✍ پروتکل/دستوالعمل تهیه اسمیر از کشت استافیلوکوکوس و رنگ آمیزی گرم در آزمایشگاه میکروبی

روش انجام آزمایش:

مقدار کمی از کلنی را با اپلیکاتور، آنس یا لوپ برداشته و با یک قطره سالین یا آب مقطر استریل بر روی لام مخلوط کنید، تا سوسپانسیون یکنواختی حاصل گردد. اسمیر را در مجاورت هوا خشک کنید. سپس به وسیله حرارت آن را فیکس کرده و رنگ آمیزی گرم را انجام می دهیم.

کشت بر روی آگار خونی جهت بررسی همولیز و رنگدانه

باکتری مورد نظر را در شرایط استریل به روش خطی بر روی محیط کشت آگار خونی تلقیح نموده و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید. پس از طی دوره انکوباسیون کلنی باکتری ها را از نظر نوع همولیز و رنگ کلنی مورد بررسی قرار دهید.

کشت بر روی محیط مانیتول سالت آگار(MSA)

باکتری مورد نظر را بر روی محیط کشت مانیتول سالت آگار در شرایط استریل تلقیح نموده و به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید. از آنجا که برخی از گونه های استافیلوکوک، مانیتول را آهسته تر تخمیر می کنند، بنابراین لازم است حتما تا ۴۸ ساعت پلیت ها نگهداری شود. در این محیط غلظت بالای نمک (۷.۵ درصد) باعث می شود که اکثر باکتری های گرم منفی و باکتری های گرم مثبت به جز استنافیلوکوک ها توانایی رشد نداشته باشند. استافیلوکوکوس اورئوس، مانیتول را تخمیر کرده و اسید تولید می کند، این مسئله منجر به تخمیر رنگ معرف فنول رد از قرمز به زرد می شود. در این آزمایش کلنی استافیلو کوکوس اورئوس به طور مشخص زرد رنگ شده و توسط هاله زردی احاطه می شود، اما سایر استافیلوکوک ها و میکروکوک ها که قدرت تخمیر مانیتول را ندارند با مصرف پیتون موجود در محیط کشت و قلیایی کردن محیط کلنی های قرمز رنگ با هاله ای ارغوانی ایجاد می کنند.

تست کواگولاز

آنزیم کواگولاز یک آنزیم اگزوآنزیم است که موجب انعقاد فیبرین پلاسمای خون و ایجاد لخته می شود. حدود ۹۷ درصد از سویه های استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت می باشند ولی سایر گونه ها کواگولاز منفی هستند. این آزماش را می توان بر روی اسلاید یا درون لوله انجام داد. در روش اسلایدی یک قطره آب بر روی اسلاید قرار داده و یک لوپ از باکتری را از محیط جامد در آن حل کنید تا یک سوسپانسیون غلیظ و یکنواخت ایجاد شود. سپس یک قطره پلاسمای سیتراته  به سوسپانسیون اضافه کرده و ۱۰ تا ۲۰ ثانیه آرام مخلوط کنید، در صورت مثبت بودن تست در عرض ۱ تا ۲ دقیقه لخته های سفید رنگی در سوسپانسیون ایجاد می شود.

تست کاتالاز

این آزمایش برای افتراق استافیلوکوک ها از استرپتوکوک ها به کار می رود. استافیلوکوک ها دارای آنزیم کاتالاز بوده و قادرند آب اکسیژنه را به آب و اکسیژن تجزیه کنند. برای انجام این تست اگر چند قطره آب اکسیژنه را روی یکی از کلنی های باکتری در سطح محیط کشت (بر روی محیط کشت آگار خونی قابل انجام نیست) بریزید. حباب های ایجاد شده نشانه وجود آنزیم و تجزیه آب اکسیژنه می باشد. تست کاتالاز را می توان بر روی یک کلنی برداشت شده بر روی اسلاید نیز انجام داد.

استافیلوکوک ها و تست های افتراقی آنها

تهیه اسمیر و روش ساخت محیط کشت آگار خونی و رنگ آمیزی استافیلوکوک ها