✍ اساس تست MTT در آزمایشگاه های سلولی

تست MTT به عنوان تستی برای بررسی میزان زنده مانی سلول یا بررسی اثر سمیت دارو ها یا دیگر مکمل ها بر سلول شناخته می شود. اما شاید در مقالات با عنوان روشی برای بررسی تکثیر و شمارش سلولی هم آورده شود. برای شمارش سلولی تکنیکی داشتیم که از لام نئوبار کمک می گرفتیم اما گاهی تعداد نمونه هایی که باید شمارش شوند، بسیار زیاد هستند. در این موارد استفاده از لام نئوبار بسیار خسته کننده است. مخصوصا اگر بخواهیم پاسخ سلول های مختلف به فاکتورهای خارجی مثل فاکتورهای رشد، داروهای سایتوتوکسیک و بقیه ی عوامل شیمیایی را ارزیابی کنیم.

فعالیت و سرعت تکثیر سلول ها ممکن است تحت تاثیر هورمون ها، فاکتورهای رشد، سایتوکاین ها و میتوژن ها افزایش داشته باشد یا تغییری نکند. همینطور بعضی از داروها و عوامل سایتوتوکسیک مثل داروهای ضد سرطان ممکن است باعث نکروز یا آپوپتوز سلول‌ها یا کاهش سرعت تکثیر و رشد آنها شود. در این موارد برای شمارش کل سلول ها از دستگاه های شمارشگر سلولی که به کولتر کانتر معروف هستند استفاده می شود. با توجه به دقت و حساسیت دستگاه باید سوسپانسیون سلولی به نسبت مناسبی رقیق و به دستگاه داده شود. معمولا حدود ۲۰۰ میکرولیتر سوسپانسیون سلولی برای شمارش سلولی با این دستگاه کافی است‌ اما نکته اینجاست که متاسفانه این دستگاه نمی تواند نسبت سلول های زنده به کل سلول ها را تعیین کند، در حالیکه اغلب برای ما شمارش سلول های زنده از شمارش کل سلول ها با ارزش تر است.

یکی از قدیمی ترین روش ها، استفاده از رنگ تریپان بلو و لام نئوبار است که حساسیت کافی ندارند و از طرفی باید با میکروسکوپ بررسی شوند و زمان بسیار زیادی می گیرند. روش های دیگر هم، مانند اندازه گیری اسیدهای هسته ای و میزان پروتئین در لیزات سلولی نیز از دقت کافی برخوردار نیستند.

اندازه گیری جذب مواد رادیو اکتیو توسط سلول های در حال رشد، روش دقیقی است که با استفاده از ترکیباتی همانند تیمیدین نشاندار شده با تریتیوم و ۵- برومودئوکسی اوریدین موقع پرولیفراسیون سلول وارد ساختمان هسته سلول شده و باعث نشاندار شدن سلول ها می شود، انجام می شود اما این روش هم بسیار وقت گیر است و نیاز به جمع آوری سلول ها بعد از تحریک سلولی دارد. از مشکلات کار با مواد رادیو اکتیو مثل دفع مواد باقی مانده و حفاظت از اشعه هم نباید غافل شد. برای همین مشکلات در سال ۱۹۸۳ روش MTT به عنوان جایگزین روش رادیواکتیو پیشنهاد شد. در این روش آنزیماتیک به عنوان سوبسترای واکنش از نمک های محلول تترازولیوم که معمول ترین آن ها MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) ) است استفاده می شود. این روش نسبت به سایر روش های بررسی پرولیفراسیون سلولی ساده تر است و با امکانات موجود در اغلب آزمایشگاه ها قابل اجراست. باید بدانیم که همه ی مراحل آزمایش در پلیت های ۹۶ خانه کشت سلول انجام می شود و نتایج با دستگاه الایزا ریدر خوانده می شود، بنابراین تعداد زیادی نمونه را می توان به صورت همزمان آزمایش کرد.

آزمایش MTT يک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شکسته شدن کریستال های زرد رنگ تترازولیوم به وسیله ی آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل کریستال های بنفش رنگ نا محلول انجام می شود. در این روش برخلاف سایر روش ها مراحل شستشو و جمع آوری سلول که اغلب باعث از دست رفتن تعدادی از سلول ها و افزایش خطای کار می شود، حذف شده و تمام مراحل آزمایش از ابتدای کشت سلول تا خواندن نتایج با فوتومتر در یک میکرو پلیت انجام می شود بنابراین تکرارپذیری، دقت و حساسیت آزمایش بالاست. در صورتی که آزمایش روی سلول های چسبیده به پلیت انجام شود، ابتدا باید تعداد مناسبی سلول (حدود ۲۰۰۰ سلول) را در هر یک از چاهک ها کشت داد و اجازه داد که سلول ها به کف پلیت بچسپند و به حالت پایدار دربیایند. سپس چاهک های کنترل و آزمایش را انتخاب می کنیم و مقدار مناسبی از ماده ی میتوژن یا داروی موردنظر را به چاهک های آزمایش اضافه می کنیم و پلیت را تا زمان مورد نیاز در انکوباتور می گذاریم تا ماده ی موردنظر روی سلول ها تاثیر کند. بعد از اتمام زمان انکوباسیون محیط کشت رویی را دور می ریزیم و به هر چاهک ۲۰۰ میکرولیتر محیط کشت حاوی نیم میلی گرم در میلی لیتر محلول MTT اضافه می کنیم و مجددا برای ۲ تا ۴ ساعت در انکوباتور دی اکسیدکربن در ۳۷ درجه سانتی گراد قرار می دهیم. در طی زمان انکوباسیون MTT توسط سیستم سوکسینات دهیدروژناز که یکی از آنزیم های چرخه ی تنفسی میتوکندریهاست احیا می شود. احیا و شکسته شدن این حلقه باعث تولید کریستال های بنفش-آبی رنگ فورمازان می شود که در زیر میکروسکوپ به راحتی قابل تشخیص هستند. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول هایی که از نظر متابولیک فعال هستند(سلول های زنده) رابطه ی مستقیم دارد. کریستال های فورمازان در آب غیر محلول هستند و باید قبل از رنگ سنجی با ماده ی حلالی مانند دی متیل سولفوکساید به حالت محلول دربیایند. در نهایت جذب نوری محلول بدست آمده را می توان در طول موج ۵۷۰ نانومتر خواند و به کمک منحنی استاندارد تعداد سلول ها را محاسبه کرد. برای هر تیره ی سلولی ارتباط خطی بین تعداد سلول ها و جذب نوری محلول نهایی وجود دارد. پس برای بررسی هر نوع سلول باید منحنی استاندارد مربوط به همان تیره ی سلولی را رسم و استفاده کرد.