✍ تخمین غلظت میکروارگانیسم های زنده و تشخیص کولیفرم از انتروباکتر

روشی است که برای تخمین غلظت میکروارگانیسم های زنده در یک نمونه با استفاده از رقیق سازی استفاده می شود. این تست معمولاً در برآورد جمعیت میکروبی در خاک ، آب ، محصولات کشاورزی و… مورد استفاده قرار می گیرد MPN معمولاً جهت آزمایش کیفیت آب به منظور اطمینان از عدم سلامت آب از نظر باکتریهای موجود در آن استفاده می شود. گروهی از باکتری ها که معمولاً به عنوان کولیفرم های مدفوعی نامیده می شوند ، به عنوان شاخص آلودگی مدفوع در آب عمل می کنند. وجود تعداد بسیار کمی از باکتریهای کلیفرم مدفوع نشان می دهد که آب احتمالاً هیچ ارگانیسم هایی را ایجاد نمی کند ، در حالی که وجود تعداد زیادی باکتری کلیفرم مدفوعی احتمال بسیار بالایی را نشان می دهد که آب می تواند حاوی بیماری باشد و برای مصرف مناسب نباشد.

بسیاری از  باکتری های ساکن در دستگاه گوارش انسان و سایر پستانداران به خانواده انتروباکتریاسه تعلق دارند. این باکتری ها باسیل های کوتاه گرم منفی می باشند که به دو دسته بزرگ تخمیر کننده لاکتوز و غیر تخمیر کننده لاکتوز تقسیم بندی می شوند. برای مثال سالمونلا، شیگلا و پروتئوس قادر به تخمیر لاکتوز نمی باشند در حالیکه کلبسیلا، اشرشیا و انتروباکتر تخمیر گننده لاکتوز هستند. این آزمایش بواسطه ۴ تست انجام می شود.

۱-آزمایش اندول (Indole)

اسید آمینه تریپتوفان در ساختمان اکثر پروتئین ها وجود دارد. باکتری هایی که آنزیم تریپتوفاناز دارند، می توانند از هیدرولیز آن مواد متابولیکی مثل؛ اندول، اسید پیروویک و آمونیاک تولید کنند. اسید پیروویک و آمونیاک بعنوان منابع غذایی به مصرف باکتری می رسد ولی اندول مصرف نشده و در محیط تجمع می یابد. با افزودن معرف کواکس به محیط می توان حضور اندول را شناسایی نمود. معرف کواکس با اندول واکنش داده و ترکیب قرمز روشنی را در سطح محیط ایجاد می کند. مشاهده این رنگ به عنوان واکنش مثبت اندول در نظر گرفته می شود و عدم مشاهده رنگ قرمز بیانگر عدم هیدرولیز تریپتوفان و واکنش منفی اندول می باشد.

پروتکل/روش انجام آزمایش اندول

۱-برای انجام این تست از محیط SIM استفاده می شود. اگر محیط SIM در دسترس نباشد می توان از محیط Tryptic Soy Broth استفاده نمود.

۲-باکتری را در شرایط استریل و به روش عمقی در محیط SIM کشت دهید.

۳-لوله های  کشت را به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

۴-پس از اتمام دوره انکوباسیون ۰.۵  میلی لیتر معرف کواکس به لوله افزوده و لوله را به آرامی تکان دهید.

۵-در صورت مثبت بودن تست  اندول رنگ قرمز ظاهر خواهد شد.

۶-نتیجه منفی با عدم تولید رنگ یا رنگ زرد روشن مشخص می شود.

 واکنش اندول، حرکت و تولید H2S در محیط SIM

۲-آزمایش متیل رد (Methyl red)

همه باکتری های روده ای گلوکز را به عنوان منبع کربن و انرژی مصرف می کنند، ولی محصولات نهایی واکنش به مسیرهای متابولیکی باکتری بستگی دارد. متیل رد به عنوان شاخص pH تغییرات اسیدیته محیط را که نتیجه تولید متابولیت های اسیدی نظیر اسید لاکتیک، اسید استیک، اسید فرمیک و … می باشد، نشان می دهد. این تست در افتراق دو باکتری اشرشیا کلی و انتروباکتر آئروژنز (تخمیر بوتان دیول) بسیار ارزشمند است.

باکتری های تخمیر کننده اسیدی مخلوط همانند اشرشیا کلی با تولید کردن انواع اسید، PH محیط را اسیدی می کنند و باکتری های تخمیر کننده بوتان دیول مثل انتروباکتر آئروژنز از تخمیر قند متابولیت های بوتان دیول، استوئین و مقدار کمی اسید تولید می کنند، در نتیجه اسیدیته محیط تغییر زیادی نمی کند. معرف متیل رد در محدوده PH=4 اسیدی قرمز رنگ است ولی در PH=6 با وجود اسیدی بودن محیط، به دلیل کاهش غلظت یون هیدروژن به رنگ زرد تغییر رنگ می دهد.

پروتکل/روش انجام آزمایش متیل رد

۱-برای انجام این تست از محیط MR-VP Broth استفاده می شود.

۲-ابتدا در شرایط استریل یک لوپ از باکتری را به درون محیط کشت تلقیح کنید.

۳-لوله های کشت را به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه نگهداری کنید.(به دلیل تخمیر آهسته برخی باکتری ها محیط کشت را به مدت ۴ تا ۵ روز تحت نظر قرار دهید.)

۴-پس از زمان انکوباسیون ۳/۱ محیط تلقیح شده را به لوله آزمایش خالی انتقال داده و برای تست VP کنار بگذارید.

۵-به ۳/۲ باقیمانده محیط کشت ۲/۰ میلی لیتر (حدود ۴ تا ۵ قطره) معرف متیل رد ریخته و از نظر MR بررسی کنید.

۶-مشاهده رنگ قرمز، مثبت شدن تست متیل رد را نشان می دهد.

۳-آزمایش وگس پروسکائر (Voges Proskauer)

با این تست می توان باکتری های تخمیر کننده گلوکز از مسیر بوتان دیول را شناسایی نمود. محلول الکلی ۴۰ درصد هیدروکسید پتاسیم و ۵ درصد آلفا نفتول تحت عنوان معرف باریت در این تست مورد استفاده قرار می گیرد. این معرف می تواند حضور استوئین را در محیط شناسایی کند. استوئین پیش ساز ۲ و ۳ بوتان دیول می باشد. معرف باریت در حضور استوئین رنگ قرمز آلبالویی تولید می کند. مشاهده رنگ قرمز در مدت ۱۵ دقیقه بعد از افزودن معرف باریت بیانگر مثبت شدن تست VP است و عدم تولید رنگ نشانه منفی شدن تست می باشد.

پروتکل/روش انجام آزمایش وگس پروسکائر

۱- باکتری را در محیط MR-VP کشت دهید.

۲-لوله های کشت را به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه نگهداری کنید.

۳-پس از دوره انکوباسیون ۶/۰ میلی لیتر آلفا نفتول و سپس ۲/۰ میلی لیتر محلول هیدروکسید پتاسیم با غلظت ۴۰ درصد را به آن اضافه نمایید.

۴-نمونه ا به خوبی مخلوط کرده و برای مدت ۱۵ دقیقه در حرارت اتاق قرار دهید.

۵-ظهور رنگ قرمز در محیط نشان دهنده حضور استوئین و مثبت بودن VP است.

واکنش های بیوشیمیایی انتروباکتریاسه در محیط MR-VP 

۴-آزمایش هیدرولیز سیترات (Citrate)

این تست توانایی باکتری ها را در مصرف سیترات بعنوان تنها منبع کربن و انرژی مشخص می کند. توانایی مصرف سیترات در باکتری به آنزیم سیترات پرمئاز (citrate permease) بستگی دارد. این آنزیم انتقال سیترات را به داخل سلول باکتری تسهیل می کند. در داخل سلول سیترات به اسید پیروویک و دی اکسید کربن تبدیل می شود. محیط کشت سیمون سیترات آگار حاوی سیترات سدیم به عنوان منبع کربن است، آمونیاک منبع نیتروژن و بروموتیمول بلو معرف PH محیط می باشد. این محیط در سطح شیب دار تهیه می گردد. اگر باکتری سیترات را اکسید کند، آن را از محیط خارج کرده و دی اکسید کربن آزاد می کند. دی اکسید کربن آزاد شده با سدیم و آب واکنش داده و کربنات سدیم تولید می کند، این ترکیب باعث قلیایی شدن محیط می شود. با افزایش PH محیط رنگ معرف برموتیمول بلو از سبز به آبی تغییر پیدا می کند، بنابراین تغییر رنگ محیط از سبز به آبی بیانگر مثبت شدن تست سیترات است و عدم تغییر رنگ نشان دهنده منفی شدن تست سیترات و عدم رشد باکتری می باشد.

پروتکل/روش انجام آزمایش هیدرولیز سیترات

۱-برای انجام این تست از محیط کشت سیترات آگار استفاده می شود. این محیط در لوله های آزمایش به شکل شیبدار تهیه می شود.

۲-در شرایط استریل باکتری را به روش کشت سطحی و عمقی در محیط تلقیح کنید.

۳-لوله های کشت را به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

۴-پس از دوره انکوباسیون مشاهده هر گونه تغییر رنگ از سبز به آبی نشانه مثبت بودن تست سیترات است.

  واکنش سیترات در محیط سیمون سیترات آگار 

نکات مهمی که در حین آزمایش IMViC باید رعایت کنید

۱-برای تست اندول محیط تلقیح شده SIM را طی ۲۴ ساعت با معرف کواکس مورد آزمایش قرار دهید، زیرا انکوباسیون طولانی مدت باعث متابولیزه شدن اندول و نتیجه منفی کاذب می شود.

۲-تست اندول را می توان علاوه بر محیط SIM با افزودن معرف کواکس به محیط تلقیح شده Tryptic Soy Broth نیز انجام داد.

۳-در آزمایش متیل رد مراقب باشید که بیش از ۵ قطره معرف متیل رد استفاده نشود، زیرا ممکن است بدون حضور متابولیت های اختصاصی رنگ محیط کشت را قرمز کند.

۴-هر محیطی که برای آزمایش سیترات به کار می رود، باید فاقد هرگونه پروتئین و کربوهیدرات به عنوان منابع دیگر کربن باشد.

۵-در تست سیترات مقدار تلقیح باکتری باید به میزان خیلی کم باشد، زیرا در غیر این صورت ترکیبات آلی موجود در دیواره باکتری های در حال تخریب، کربن و نیتروژن زیادی آزاد کرده و می توانند واکنش مثبت کاذب ایجاد کنند.