در مطالب دو جلسه گذشته در رابطه با این که تکنیک HRM (High Resolution Melting Analysis)
چیست ، چه کاربردهایی دارد و چه رنگ ها و دستگاه هایی برای این تکنیک استفاده می شود برایتان گفتیم در این مطلب مراحل انجام این تکنیک برای شما گفته خواهد شد.

برای انجام یک HRM باید ۵ مرحله را انجام داد :

۱- کالیبر دستگاه:
(این مرحله باید توسط شرکت سازنده انجام شود.) کالیبر صحیح دستگاه قبل از هر استفاده لازم است. زیرا رنگ های دارای طیف انتشار مختلف می باشند، توصیه می شود که تولیدات سازنده های مختلف را در یک مرحله ی کاری استفاده نکنید. استفاده از مخلوط های واکنش متفاوت نیاز به انجام کالیبر مجدد دستگاه دارد .

۲- طراحی روش:
این مرحله برای انجام آنالیز HRM ضروری است. کیفیت DNA، انتخاب صحیح پرایمر، انتخاب مواد و پروتکل های بهینه هم به عنوان کلیدی برای به دست آوردن بهترین نتایج نقش دارند. با توجه به حساسیت و ماهیت HRM، یک تفاوت کوچک در راه اندازی اولیه تا حد زیادی روی نتایج پایانی تأثیر گذار است. دستیابی به یک تکثیر اختصاصی برای موفقیت روش یک عامل حیاتی است، زیرا قطعات غیر اختصاصی تا حدود زیادی تجزیه و تحلیل آنالیز ذوب را متخل می کنند.
نمونه DNA الگو: مقدار و کیفیت DNA یکی از فاکتورهای اصلی است که می تواند بر روی کیفیت نتایج تأثیر گذار باشد. انتقال محتویات بافر ( نمک، پروتئین و …) در زمان های آماده سازی DNA یکی از موارد مشکل ساز می باشد.تکنیک های استخراج DNA نامناسب می تواند مشکل انتقال بافر را تشدید کند، بافرهای حاوی نمک باعث تغییرات رفتاری ذوب قطعه ی PCR می شود و باعث کاهش حساسیت نتایج، تکرارپذیری پایین و ژنوتایپینگ اشتباه می شود . انتقال بافر همراه با DNA الگو نه تنها باعث تغییرات Tm و رفتار ذوب شدگی در زمان HRM می شود، بلکه باعث احتمال تکثیر غیر اختصاصی الگو در زمان انجام PCR می شود.
نکاتی که بهتر است رعایت شود، شامل:
✅به طور ایده آل بهتر است که همه ی استخراج ها ی الگو توسط یک نوع کیت تجاری یا یک روش دستی استاندارد انجام شود. بعضی از کیت ها دارای غلظت های بالایی از نمک برای شستشوی DNA از ستون هستند، همه ی نمونه ها باید با بافر کم نمک که به طور ایده آل حاوی Tris-HCL با غلظت ۱۰ میلی مولار و PH:8.5 هستند، شسته شوند. نمونه ها با غلظت بالای DNA را نیز با این بافر رقیق کنید، که باعث کاهش اختلاف غلظت میزان بافر بین نمونه ها می شود. علاوه بر این زمانی که حجم نمونه ی DNA کاهش پیدا می کند، میزان انتقال نمک در واکنش را کمتر می کند و به طور ایده آل کم ترین حجم نمونه ی الگو که باید به دقت استفاده شود، ۱ تا ۲ میکرولیتر می باشد.
✅همه ی نمونه ها باید دارای غلظت یکسانی از DNA باشند، مقدار غلطت توصیه شده بر اساس نوع نمونه ی مختلف فرق دارد، به عنوان مثال، میزان غلظت مورد استفاده DNA ژنومی بین ۱۰۰ پیکوگرم تا ۱۰ نانوگرم، مقدار DNA پلاسمیدی بین ۱۰ فمتوگرم تا ۱ نانوگرم و میزان DNA تکثیر یافته محصول PCR بین ۱ فمتوگرم تا ۱۰ پیکوگرم می باشد.در غلظت پایین از الگو احتمال ایجاد یک جهش در زمان PCR وجود دارد که رفتار ذوب شدگی را تحت تأثیر قرار می دهد ، در غلظت بالایی از DNA نیز فلورسنس زمینه باعث افزایش میان کنش رنگ با DNA دو رشته ای می شود.

پرایمر:طراحی پرایمر نیز به عنوان یک چالش برای آنالیز HRM می تواند باشد و طراحی یک پر ایمر با کیفیت بالا باعث بهبود نتایج پایانی می شود. هر چه قدر محصول تولیدی پرایمر کوچک تر باشد، حساسیت واکنش تکثیر و آنالیز HRM بیشتر می شود. میزان غلظت پرایمر مورد استفاده نیز مثل شرایط PCR استاندارد بین ۰.۰۵ تا ۰.۱ میکرومول می باشد.اندازه ی محصول تولیدی پرایمر نیز بهتر است که بین ۷۰ تا ۱۵۰ جفت باز باشد.

غلظت منیزیم : MgCl2 روی میزان بازده واکنش تکثیر تأثیر زیادی دارد. میزان غلظت منیزیم روی حساسیت HRM نیز تأثیر می گذارد. اما غلظت بهینه ای از منیزیم که برای واکنش PCR بهینه شده است، لزوما غلظت بهینه برای آنالیز HRM نیست.

اثر افزایش دهنده های PCR بر روی آنالیز HRM: افزایش دهنده های PCR به طور معمول برای کاهش تولید محصولات غیر اختصاصی، کاهش سیکل های PCR و افزایش بازده تکثیر به مخلوط واکنش اضافه می شوند. برای تکثیر قطعات غنی از GC از DMSO کمک گرفته می شود. که بر روی آنالیز HRM تأثیر قابل توجهی ندارد.

۳-واکنش PCR: 

بعد از انجام Real Time PCR، قطعه های تولیدی را می توان بررسی کرد و خطاهای احتمالی را پیدا و حل کرد. اگر آزمایش PCR بهینه شود. ممکن است که PCR را بتوان بر روی یک دستگاه دیگر انجام داد ( سرعت رمپ بین دستگاه های مختلف، متفاوت است، زمان اتصال و طویل سازی نیاز به تنظیم دارد) و محصول واکنش را در دستگاه دیگری که دارای قابلیت HRM است، مورد آنالیز قرار داد.

۴- مرحله HRM: مرحله ی HRM بعد از سیکل نهایی PCR انجام می شود، پروتکل های تنظیمی مختلف را می توان انجام داد که معمولا پله های افزایش دمایی ۰/۰۰۸ درجه تا ۰/۲ درجه با زمان نگهداری ۲ ثانیه انجام می شود. با این حال ، برخی دستگاه ها اجازه ی افزایش با قابلیت انعطاف پذیری این چنینی را نمی دهند و فقط دارای یک پروتکل غیر قابل تنظیم هستند.

۵– آنالیز داده ها :آنالیز داده ها باید با یک نرم افزار مناسب انجام بگیرد، نرم افزارهای مخصوص HRM از الگوریتم های مختلفی برای آنالیز داده ها استفاده می کنند و برای تمایز بهتر اختلاف میان واریانت ها، نتایج را به صورت فرمت های ساده ای نشان می دهند. این نرم افزارها معمولا توسط خود شرکت های سازنده عرضه می شوند.
این بسیار مهم است که ما بدانیم به دنبال چه چیزی هستیم و انتظارمان از نتیجه ی آنالیز چه چیزی می باشد( شناخت کافی از توالی مورد نظر داشته باشیم).
نتایج گراف های منحنی ذوب با وضوح پایین به صورت اختلاف فلورسنس به اختلاف دما بر روی محور دما نشان داده می شود (T-dF/dT).با این حال داده و گراف های HRM به صورت متفاوتی مشاهده و آنالیز می شود.

در این مطلب به اینجا رسیدیم که طی انجام مراحل HRM داده هایی را به دست می آوریم که حال باید آنها را آنالیز کنیم پس با ما همراه باشید تا در مطلب بعدی داده های به دست آمده از تکنیک HRM را بررسی کنیم.