✍  کاربرد تکنولوژی DNA نوترکیب در بیوتکنولوژی(تولید پروتئین در سلول های پستانداران و تولید پروتئین در سلول های حشرات)

 دومین گونه مخمری که می تواند مقادیر زیادی پروتئین های نوترکیب (۰تا ۳۰% کل پروتئین های سلول) تولید کند و توان گلیکوزیلاسیون پیکیاپاستوریس بسیار شبیه سلول های جانوری دارد چیست؟  

گرچه ساکارومایسس سرویزیه محبوب بسیاری از زیست شناسان مولکولی است، اما یوکاریوت های میکروبی دیگری وجود دارند که توان تولید پروتئین های نوترکیب در آنها اگر بیشتر از ساکارومایسس سرویزیه نباشد، کمتر نیست یا مساوی آن است. به طور خاص پیکیا پاستوریس دومین گونه مخمری است که می تواند مقادیر زیادی پروتئین های نوترکیب ۰تا ۳۰% کل پروتئین های سلول) تولید کند و توان گلیکوزیلاسیون پیکیا پاستوریس بسیار شبیه سلول های جانوری است.
ساختار قندی که توسط این مخمر ساخته می شود دقیقاً مشابه نوع جانوری نیست؛ اما تفاوت ها، نسبتاً جزئی هستند و احتمالاً اثر مهمی بر فعالیت پروتئین نوترکیب نمی گذارد. از همه مهمتر این است که اگر پروتئین های گلیکوزیله تولید شده توسط پیکیا پاستوریس به خون تزریق شوند، باعث القای واکنش آنتی ژنی نمی شوند در حالی که پروتئین های هایپر گلیکوزیله ساخته شده توسط ساکارومایسس سرویزیه چنین مشکلی را دارند. در وکتورهای بیانی پیکیا پاستوریس از پروموتر الکل اکسیداز ( AOX) استفاده شده است که با متانول تحریک می شوند. تنها مشکل مهم در مورد پیکیا پاستوریس تجزیه پروتئین نوترکیب تولید شده قبل از خالص سازی آن ها است که می توان با استفاده از محیط کشت مخصوصی این مشکل را کنترل کرد. دیگر مخمرهایی که برای تولید پروتئین های نوترکیب استفاده شده اند شامل Hansenula polymorpha ، Yarrowia lipolytica ، Kluveromyces lactis هستند. مورد آخر به دلیل توانایی رشد روی مواد زاید حاصل از از صنایع غذایی بسیار مورد توجه است.

Aspergillus nidulans و Trichoderma reesei نیز محبوب ترین قارچ های رشته ای در کلونینگ هستند. مزایای این قارچ در داشتن توان گلیکوزیلاسیون مناسب و ترشح پروتئین به محیط کشت است.  یک خصیصه مهم در تریکودرمارسئی از قارچ های پوشاننده چوب است که به طور طبیعی آنزیم های تجزیه کننده چوب ترشح می شود و در محیط زندگیشان وجود دارد. داشتن سیستم ترشحی به این معنی است که این قارچ ها می توانند پروتئین های نوترکیب را به نحوی بسازند که خالص سازی آن ها آسانتر است. وکتورهای بیانی اسپرژیلوس نیدولانس معمولاً پروموتر گلکوآمیلاز را دارند که به وسیله نشاسته تحریک و در حضور زایلوز خاموش می شود. در وکتورهای تریکودرمارسئی از پروموتر سلوبیوهیدرولاز استفاده می شود که در حضور سلولز تحریک می شود.
استفاده از سلول های جانوری در تولید پروتئین های نوترکیب وجود مشکلات ذاتی در تولید پروتئین های جانوری فعال در میزبان های میکروبی، بیوتکنولوژیست ها را برای بررسی امکان استفاده از سلول های جانوری برانگیخت. در مورد پروتئین هایی که ساختار گلیکوزیلاسیون پیچیده و ضروری دارند، سلول های جانوری احتمالا تنها میزبان برای تولید پروتئین فعال باشند.

تولید پروتئین در سلول های پستانداران

سیستم های کشت سلول جانوری از اوایل دهه ۱۹۶۰ ابداع شدند اما روش های کشت مداوم در طی ۳۰ سال اخیر در دسترس قرار گرفته اند. مشکلی که در مورد برخی رده های سلول های جانوری وجود دارد نیاز این سلول ها به رشد روی سطح جامد است که طراحی و ساخت ظروف کشت را با پیچیدگی هایی همراه می کند. یک راه حل پر کردن داخل ظروف کشت با صفحاتی است که بتوانند سطح بزرگ تری را ایجاد نکنند؛ اما این روش معایبی نیز دارد (امکان مخلوط کردن کامل و مداوم محیط کشت درون این ظرف به سختی انجام می شود). راه حل دوم این است که در داخل ظرف استاندارد ذرات کوچک خنثی (مثل دانه های سلولز) اضافه شود تا سلول ها بر روی آن رشد کنند. سرعت رشد و حداکثر تراکم سلولی در سلول های جانوری در مقایسه با میکروارگانیسمها بسیار کم است که این موضوع محصول تولید پروتئین های نوترکیب را محدود می کند اما اگر کشت سلول های جانوری تنها راه رسیدن به پروتئین فعال باشد، این محدودیت ها قابل تحمل هستند.
البته برای بدست آوردن یک پروتئین جانوری از کشت سلول جانوری، کلون کردن ژن ممکن است ضروری نباشد؛ اما وکتورهای بیان و ژن های کلون شده همچنان استفاده می شود تا بازده تولید افزایش یابد که این از طریق قراردادن ژن تحت کنترل پروموتری قوی تر از پروموتر طبیعی خود ژن می باشد.
پروموترهای قوی اغلب از ویروس هایی مثل SV40، سایتومگالوویروس (CMV) یا ویروس روس سارکوما (RSV) بدست می آید. از رده های سلولی پستانداران مشتق شده از انسان یا همستر برای تولید چندین پروتئین نوترکیب استفاده شده است. در بسیاری از موارد پروتئین حاصل به طور صحیح پردازش شده است و قابل تمایز از پروتئین غیر نوترکیب نیست. البته تولید پروتئین های نوترکیب با این روش بسیار گران بها است به خصوص احتمال همراه شدن ویروس با پروتئین وجود دارد که نیازمند آزمایشات کنترل کیفی وسیعی است تا از ایمنی و سلامت محصولات مطمئن شویم.

تولید پروتئین در سلول های حشرات

برای تولید پروتئین های جانوری، سلول های حشرات جایگزین سلول های پستانداران شده اند. رفتار سلول های حشرات در کشت متفاوت از سلول های پستانداران نیست، اما دارای مزیت بالایی نیز می باشد که به طبیعت سیستم بیانی آن ها مربوط می شود و امکان تولید بالای پروتئین های نوترکیب را ایجاد می کند.
سیستم بیانی سلول های حشرات بر پایه باکلوویروس ها است. باکلوویروس ها گروهی از ویروس ها هستند که بین حشرات مشترک اند اما معمولاً مهره داران را آلوده نمی کنند. ژنوم باکلوویروس حاوی ژن پلی هیدرین است که محصول آن در انتهای چرخه عفونت به صورت اجسام انکلوزین بزرگی در هسته سلول حشره انباشته می شود. محصول این ژن تک نسخه ای حدود ۵۰% کل پروتئین های سلول را تشکیل می دهد.
اگر این ژن با یک ژن خارجی جایگزین شود، چنین سطحی از تولید پروتئین مربوطه رخ می دهد. وکتورهای باکلوویروس به طور موقت برای تولید تعدادی از پروتئین های پستانداران استفاده شده اند، اما متأسفانه پروتئین های حاصل به طرز صحیحی گلیکوزیله نمی شوند. به این دلیل سیستم باکلوویروسی در مقایسه با پیکیاپاستوریس و ساکارومایسس سرویزیه مزیتی ندارد، هرچند ناکارایی سیستم گلیکوزیلاسیون حشره می تواند از طریق استفاده از باکلوویروس های تغییر یافته که حاوی پروموتر پستانداران برای بیان ژن هستند تا ژن را به طور مستقیم در سلول های پستاندار بیان کنند، برطرف شود. عفونت ایجاد شده با این ویروس زایا نمی باشد، یعنی ژنوم ویروس نمی تواند همانند سازی کند اما ژن های کلون شده در وکتور BacMam برای مدت کافی جهت بیان ژن در سلول های پستانداران پایدار می ماند. پروتئین بیان شده به وسیله فرآیندهای پس از ترجمه ای مربوط به خود سلول پستاندار پردازش می شود و پروتئین های نوترکیب حاصل به درستی گلیکوزیله شده و کاملاً فعال است.

به طور قطع باکلوویروس ها به طور طبیعی حشرات زنده را آلوده می کنند نه کشت سلولی. برای مثال یکی از انواع رایج باکلوویروس هایی که در کلون کردن استفاده می شود، نوکلئوپلی هیدروویروس Bombyx mori (BmNPV) است که پاتوژن طبیعی کرم ابریشم است. حضور صنعت وسیع تولید ابریشم از کرم ابریشم امکان استفاده از پتانسیل وکتورها براساس ژنوم (BmNPV) جهت تولید پروتئین نوترکیب را فراهم می کند. این شیوه آسان و ارزان است و همچنین این ویروس ها در انسان بیماریزا نمی باشند در نتیجه از حضور ویروس های خطرناک در محصولات اجتناب می شود.

تکنیک  تولید پروتئین از ژن های‌ ‌کلون شده – بخش اول

تکنیک  تولید پروتئین از ژن های کلون شده – بخش دوم

تکنیک تولید پروتئین از ژن های کلون شده – بخش سوم