✍ کاربرد تکنولوژی DNA نوترکیب در بیوتکنولوژی(تولید پروتئین های نوترکیب از مخمر و قارچ های رشته ای و تولید پروتئین نوترکیب در سلول های یوکاریوتی)

وکتورهای ِویژه جهت بیان ژن های خارجی ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌در Ecoli

اگر ژن خارجی(غیر باکتریایی)به سادگی به داخل وکتور استاندارد وارد و در E.coli کلون شود سنتز قابل توجهی از پروتئین نوترکیب بسیار غیر محتمل خواهد بود، زیرا بیان ژن به مجموعه ای از سیگنال ها که ژن را احاطه کرده و به وسیله باکتری مورد شناسایی قرار می گیرند وابسته می باشد، این سیگنال ها که توالی های کوتاه نوکلئوتیدی هستند، نشان دهنده حضور ژن در آن ناحیه می باشند و ساختارهایی جهت دستگاه ترجمه و رونویسی سلول را فراهم می آورند. از مهم ترین سیگنال های موجود در ژن های E.coli می توان به سه مورد زیر اشاره کرد:

۱. پروموتور

۲. ترمیناتور

۳ . جایگاه اتصال ریبوزوم

۱.پروموتور : که نشان دهنده نقطه شروع رونویسی می باشد . در E.coli پروموتور توسط زیر واحد σ آنزیم رونوشت بردار RNA پلیمراز مورد شناسایی قرار می گیرد .
۲. ترمیناتور : نشاندهنده نقطه پایان رونویسی می باشد, که رونویسی بایستی در آنجا متوقف شود . خاتمه دهنده معمولا توالی نوکلئوتیدی می باشد که می تواند باجفت شدن بازهای خویش ساختار ساقه-حلقه تشکیل دهد .
۳. جایگاه اتصال ریبوزوم : توالی کوتاه نوکلئوتیدی است که توسط ریبوزوم به عنوان نقطه ای که مولکول mRNAبایستی به آن متصل شود عمل می کند. کدون شروع ژن معمولا چند نوکلئوتید پایین دست این جایگاه قرار دارد .

ژن های ارگانیسم های عالی همچنین به وسیله سیگنال های بیان احاطه شده اند، اما توالی های نوکلئوتیدی آن ها با نسخه موجود در E.coli متفاوت است،
این موضوع به وسیله مقایسه پروموتر ژن های E.coli و انسان شرح داده شده است. با اینکه تشابهاتی وجود دارد اما اتصال RNAپلیمراز E.coli به پروموتر انسان غیر محتمل است. ژن های خارجی در E.coli غیر فعال باقی می مانند فقط به خاطر اینکه باکتری قادر به شناسایی سیگنال های بیان آن ها نیست. راه حل این مشکل قرار دادن ژن های خارجی در داخل وکتور است به صورتی که این ژن تحت کنترل مجموعه ای از سیگنال های بیان E.coli قرار بگیرد که در صورت نائل شدن به این امر رونویسی و ترجمه انجام می گیرد. بنابراین وکتور های کلونینگی که دارای این سیگنال ها هستند و می توانند درتولید پروتئین نوترکیب مورد استفاده قرار گیرند، وکتورهای بیانی نامیده می شوند.
پروموتر مهم ترین جزء وکتور بیانی است به این دلیل که پروموتر مراحل خیلی ابتدایی بیان ژن (اتصال آنزیم RNAپلیمراز به DNA) را کنترل و سرعت سنتز mRNA را تعیین می کند، بنابراین مقدار پروتئین نوترکیب حاصل به مقدار فعالیت پروموتر بستگی دارد. در نتیجه پروموتر باید به دقت انتخاب شود.

کاست و اتصالات ژنی

یک وکتور بیانی کارامد علاوه بر پروموتر قابل تنظیم و قوی به توالی اتصال به ریبوزوم E.coli و خاتمه دهنده نیاز دازد. در بیشتر وکتورها، سیگنال های بیانی یک کاست را تشکیل می دهند. این نام گذاری به این دلیل است که ژن خارجی به درون جایگاه آنزیم محدودالاثر منحصر به فردی که در میانه مجموعه سیگنال بیانی قرار دارد وارد می شود. بنابراین اتصال ژن خارجی به درون کاست، آن را در موقعیت ایده آلی نسبت به سیگنال ها قرار می دهد. در بعضی از وکتورها کاست جایگاه کلون کردن دقیقا مجاور توالی اتصال به ریبوزوم نیست بلکه بعد از قطعه ای از ابتدای یک ژن E.coli قرار دارد. دخول ژن خارجی به درون جایگاه برش آنزیم محدودالاثر باید به گونه ای انجام شود که دو قالب خواندن را ادغام کند. به این ترتیب یک ژن هیبرید تولید می شود که با قطعه ژنی مربوط به E.coli شروع شده و بدون وقفه به کدون های ژن خارجی متصل شود. بنابراین محصول بیان این ژن یک پروتئین فیوژن (Fusion protein) می باشد که از پپتید کوتاه رمز شده به وسیله قالب خواندن E.coli که به انتهای آمینوی پروتئین خارجی متصل شده، تشکیل شده است.

تولید پروتئین نوترکیب در سلول های یوکاریوتی

مشکلاتی که برای بدست آوردن میزان بالای پروتئین های نوترکیب فعال در E.coli وجود دارد، موجب شد تا سیستم های بیانی دیگری ایجاد شوند. تلاش هایی برای استفاده از باکتری های دیگر به عنوان میزبانی برای تولید پروتئین های نوترکیب انجام شد و پیشرفت هایی هم در Lactococcus lactis و گونه های Pseudomonas انجام شد اما جایگزین اصلی یوکاریوت های میکروبی می باشند. بحث این است که یک یوکاریوت میکروبی مثل مخمرها یا قارچ های رشته ای ارتباط نزدیک تری به سلول های جانوری دارند و بنابراین می تواند پروتئین های نوترکیب کاراتری نسبت به E.coli تولید کنند. مخمر ها و قارچ ها به آسانی باکتری ها در کشت های مداوم رشد می کنند و می توانند ژن های کلون شده موجودات زنده عالی تر را بیان کنند و پروتئین حاصل را به روشی مشابه آنچه خود موجودات عالی تر انجام می دهند، پردازش کنند.

پروتئین های نوترکیب از مخمر و قارچ های رشته ای

محققان به پتانسیل بالای یوکاریوت های میکروبی پی برده اند و امروزه از این موجودات برای تولید روتین بسیاری از پروتئین های جانوری استفاده می شود. وکتورهای بیانی هنوز مورد نیاز هستند زیرا پروموتر و سایر سیگنال های بیانی ژن های جانوری به طور کارآمدی در یوکاریوت های پست عمل نمی کنند.
ساکارومایسس سرویزیه میزبانی برای تولید پروتئین های نوترکیب این مخمر رایج ترین یوکاریوت میکروبی برای تولید پروتئین های نوترکیب است. ژن کلون شدها اغلب تحت کنترل پروموتر GAL قرار دارد که به طور طبیعی در فرادست ژن گالاکتوز اپی مراز قرار دارد.
این آنزیم در متابولیسم گالاکتوز دخالت دارد. پروموتر GLA در حضور گالاکتوز تحریک شده و بیان ژن کلون شده را ایجاد می کند. دیگر پروموترهای مفید PHO5 (که به وسیله سطح فسفات موجود در محیط کشت تنظیم می شود) و CUP1 (که در حضور مس القا می شود) هستند. بسیاری از وکتور های بیانی مخمر، توالی خاتمه ساکارومایسس سرویزه را دارندزیرا علائم خاتمه جانوری در مخمر کارایی ندارد. با اینکه بازده پروتئین نوترکیب بسیار بالاست، اما ساکارومایسس سرویزیه نمی تواندگلیکوزیلاسیون صحیح پروتئین های جانوری را انجام دهد و اغلب تعداد زیادتری از واحدهای قندی را به پروتئین اضافه می کند (هایپرگلیکوزیلاسیون)، اما با استفاده از سویه های جهش یافته ساکارومایسس سرویزیه می توان هایپرگلیکوزیلاسیون را متوقف کرد یا حداقل کاهش داد. علاوه بر آن ساکارومایسس سرویزیه سیستم کارایی برای ترشح پروتئین ها به درون محیط کشت را ندارد. در غیاب مکانیسم ترشح، پروتئین های نوترکیب در داخل سلول باقی می مانند و به سادگی خالص سازی نمی شوند. بعلاوه codon bias یا تبعیض کدونی نیز یک مشکل دیگر است.
اعلی رغم تمام مشکلات ساکارومایسس سرویزیه رایج ترین یوکاریوت میکروبی برای تولید پروتئین های نوترکیب باقی مانده است زیرا این ارگانیسم برای تولید پروتئین های نوترکیب مورد استفاده در پزشکی یا صنایع غذایی نسبتا ایمن است و به دلیل کسب دانش غنی از ویژگی های بیوشیمیایی و ژنتیکی ساکارومایسس سرویزیه در سال های اخیر، بسیار راحت تر می توان تدابیر مناسب برای کاهش مشکلات ایجاد شده اتخاذ نمود.

تکنیک تولید پروتئین از ژن های‌ ‌کلون شده – بخش اول