✍ پروتکل تهیه اسمیر از کشت استرپتوکوک و رنگ آمیزی گرم و نحوه انجام آزمایش CAMP

استرپتوکوک های گروه D در کدام بخش های بدن حمل می شوند و با عفونت های کدام بخش ها در ارتباط هستند؟

استرپتوکوک های گروه D به دو گروه انتروکوک ها (انتروکوک فکالیس) و غیر انتروکوک ها (استرپتوکوک بویس) تقسیم بندی می شوند. این باکتری ها در دستگاه گوارش، حفره دهانی و دستگاه تناسلی حمل می شوند و با عفونت های ادراری، اندوکاردیت و آبسه شکمی در ارتباط هستند.

استرپتوکوک های گروه D در محیط بایل اسکولین آگار رشد می کنند و اسکولین محیط را هیدرولیز کرده و رنگ سیاه ایجاد می کنند. از طرفی صفرای گاوی (oxgall) از رشد باکتری های گرم مثبت به جز انتروکوک ها جلوگیری می کند. مثبت شدن این واکنش بیانگر مقاومت در برابر صفرا و توانایی هیدرولیز اسکولین می باشد، در حالیکه سایر استرپتوکوک ها در مجاورت نمک های صفراوی قادر به رشد نیستند.

وجه تمایز استرپتوکوک های گروه D از دیگر کوکسی های گرم :

1. رشد در محدوده دمایی گسترده (۱۰ تا ۴۵ درجه سانتیگراد)
2. رشد در محیط حاوی ۶.۵ درصد نمک
3. هیدرولیز اسکولین در حضور ۴۰ درصد صفرا
4. هیدرولیز L-پیرولیدوفیل-بتا-نفتیل آمید (PYR)

استرپتوکوک های ویریدنس، آلفا همولیتیک بوده و در اطراف کلونی باکتری در محیط آگار خوندار هاله سبز رنگی تولید می شود. این باکتری ها توسط اپتوشین مهار نمی شوند و اینگونه می توان آن را از استرپتوکوک پنومونیه افتراق داد.

استرپتوکوک های ویریدنس از نظر آنتی ژنی به آسانی طبقه بندی نمی شوند، تعدادی غیر قابل تیپ بندی هستند و تعدادی نیز با آنتی بادی ضد O،M،K،H،G،F آگلوتینه می شوند. استرپتوکوک های ویریدنس ۳۰ تا ۶۰ درصد فلور طبیعی دهان را تشکیل می دهند، همچنین بعنوان عامل پوسیدگی دندان و آندوکاردیت شناخته شده اند.

استرپتوکوک پنومونیه یا پنوموکوک ها در دستگاه تنفسی فوقانی ۵ تا ۷۰ درصد از جمعیت بصورت غیر علامت دار حمل شده، ولی می تواند بصورت فرصت طلب عامل پنومونی، اوتیت، کونژکتیویت و سینوزیت باشد. پنوموکوک ها فاقد آنتی ژن های لانسفیلد هستند.

در محیط آگار خونی همولیز آلفا تولید می کنند و براساس ۳ معیار از استرپتوکوک های ویریدنس قابل افتراق می باشند:

1. حساسیت به اپتوشین: پنوموکوک در اطراف دیسک آغشته به یک رنگ تحت عنوان اپتوشین(اتیل هیدروکوپرئین هیدروکلراید) بر روی آگار خوندار مهار می شوند.
2. حلالیت در صفرا: پنوموکوک در صفرا حل می شود و هنگامی که در محیط مایع حاوی ۱۰ درصد دزوکسی کولات قرار گیرد، سریعا لیز می شود.
3. تزریق به حیوان حساس- تزریق داخل صفاقی به موش باعث مرگ سریع موش می شود.

آنتی ژن کلیدی پنوموکوک کپسول اختصاصی تیپ می باشد. سروتیپ کپسولی را می توان براساس واکنش تورم کپسولی تحت عنوان واکنش کوالانگ (quellung reaction) تعیین کرد.

اساس این تست واکنش کپسول پلی ساکاریدی باکتری و آنتی سرم هم تیپ خودش و نهایتا تورم کپسول می باشد. برای این منظور سوسپانسیون کشت را روی یک لام قرار داده و در مجاورت هوا خشک کنید، سپس یک لوپ کامل از آنتی سرم ضد پنوموکوک که حاوی متیلن بلو است به آن اضافه کرده، اسلاید را انکوبه کرده و با میکروسکوپ مطالعه کنید.

واکنش تورم کپسولی پنوموکوک

مشخصات تشخیصی و افتراقی استرپتوکوک های مهم از نظر پزشکی                         

دستورالعمل/روش آزمایش: تهیه اسمیر از کشت استرپتوکوک و رنگ آمیزی گرم

مقدار کمی از کلونی را با اپلیکاتور، آنس یا لوپ برداشته و با یک قطره سالین یا آب مقطر استریل بر روی لام مخلوط کنید، تا سوسپانسیون یکنواختی حاصل گردد. اسمیر را در مجاورت هوا خشک کنید. سپس بوسیله حرارت آن را فیکس کرده و رنگ آمیزی گرم را انجام دهید.

کشت بر روی محیط آگار خونی و تعیین حساسیت نسبت به باسیتراسین و SXT

1. محیط کشت آگار خونی را به دو قسمت مساوی تقسیم کرده و در یک قسمت استرپتوکوک گروه A بتا همولیتیک و در قسمت دیگر استرپتوکوک های غیر گروه A را به روش خطی کشت دهید
2. یک دیسک باسیتراسین و یک دیسک SXT در هر دو قسمت پلیت قرار دهید
3. پلیت را به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید

نحوه انجام آزمایش CAMP

1. برای انجام آزمایش CAMP ابتدا استافیلوکوکوس اورئوس بتا همولیتیک را بصورت یک خط مستقیم در وسط محیط کشت آگار خونی تلقیح کنید
2. سپس نمونه مجهول را عمود بر خط کشت استافیلوکوک کشت داده بطوریکه این دو باهم برخورد و تداخل نکنند. (می توان چند نمونه را بطور همزمان با خطوط مجزا و عمود بر خط کشت استافیلوکوک مورد آزمایش قرار داد)
3. پلیت را به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید
4. مشاهده همولیز بتا، شبیه نوک پیکان در محل تلاقی دو خط کشت عمود بر هم نشان دهنده تشدید همولیز بتا و تست CAMP مثبت است.

کشت در محیط بایل اسکولین آگار

1. محیط کشت بایل اسکولین آگار را در شرایط استریل با نمونه مورد نظر تلقیح کنید
2. پلیت را به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید. توجه داشته باشید که برخی از سویه ها به زمان انکوباسیون بیشتری (۴۸ ساعت) نیاز دارند
3. سیاه شدن محیط دلالت بر مثبت بودن نتیجه آزمایش دارد. (کلیه استرپتوکوک های گروه D انتروکوک و غیر انتروکوک قادر به هیدرولیز اسلولین می باشند.)

نکات مهم در حین انجام آزمایش:

1. گاهی می توان هاله همولیز را در محیط آگار خونی بوسیله بزرگنمایی کم میکروسکوپ(۴X) بررسی نمود
2. در شرایط بی هوازی یا در محیط CO2 دار استرپتوکوک های گروه A آزمایش CAMP مثبت ایجاد می کنند، بنابراین پلیت کشت باید حتما در حضور .اکسیژن نگهداری شود

مقدمه ای در رابطه با استرپتوکوک ها

روش آزمایش تهیه اسمیر از کشت استرپتوکوک و تست های تکمیلی این رده