✍ مفهوم پروتئوم  و کاربردهای آن

پروتئوم به معنی کل پروتئین های موجود در سلول می باشد. مطالعه های پروتئوم(همچنین پروتئومیکس نامیده می شود) اطلاعات بیشتری را که به سادگی در مطالعات و آزمایشات ترانسکریپتوم به دست نمی آید، فراهم می کند. آزمایشات ترانسکریپتوم اطلاعات صحیحی در مورد فعال بودن یک ژن را در یک سلول خاص فراهم می کند، اما اطلاعات کمتری در مورد پروتئین های موجود در آن سلول می دهد. دلیل این امر این است که فاکتورهایی که بر محتوای پروتئین داخل یک سلول اثر می گذارد فقط مقدار RNA های در دسترس نیست، بلکه میزان ترجمه یک مولکول mRNA به پروتئین و میزان تجزیه پروتئین ها نیز موثر هستند.

روش مورد استفاده برای شناسایی عناصر یک پروتئوم، پروفایلینگ (یا الگوبرداری) پروتئین نامیده می شود. این روش بر اساس دو تکنیک می باشد. این دو تکنیک الکتروفورز پروتئین و طیف سنجی جرمی می باشد که هر دوی آن ها دارای شجره نامه طولانی هستند، اما آن ها به  ندرت در زمینه پری ژنومیک با هم بکار برده می شوند.

جداسازی پروتئین ها در یک پروتئوم

برای مشخص کردن ویژگی و عناصر پروتئوم مورد نظر، اولین مرحله مورد نیاز فراهم کردن نمونه های خالصی از پروتئین های تشکیل دهنده اش است. یک سلول پستاندار ممکن است دارای ۱۰۰۰۰ تا ۲۰۰۰۰ پروتئین مختلف باشد، به نحوی که به یک سیستم جداسازی خیلی دقیقی نیاز است. ژل-الکتروفورز پلی آکریلامید، یک روش استاندارد برای جداسازی پروتئین های یک مخلوط است. بسته به ترکیب ژل و شرایطی که تحت آن الکتروفورز انجام می شود، می توان ویژگی های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی را اساس جداسازی پروتئین قرار داد.

در تکنیک و روش مشهورتری از یک شوینده به نام سدیم دو سیل سولفات استفاده می شود. این شوینده باعث دناتوره شدن پروتئین ها و انتقال بار منفی به آن ها می شود. تحت این شرایط، پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی شان جدا می شوند به طوری که پروتئین های کوچک تر خیلی سریع تر به سمت الکترود مثبت حرکت می کنند. از سوی دیگر، می توان پروتئین ها را با روش ایزوالکتریک فوکوسینگ جداسازی کرد. در این روش از ژل هایی استفاده می شود که دارای مواد شیمیایی می باشد که زمانی بار الکتریکی به ژل وارد شود موجب ثابت نگه داشتن شیب PH در ژل می شوند. در این نوع ژل ها، پروتئین ها به سمت نقطه ایزوالکتریک شان حرکت می کنند، نقطه ای که در آن بار خالص پروتئین صفر است.

در پروفایلینگ پروتئین، این روش­ها به همراه ژل الکتروفورز دو بعدی بکار می رود. در مرحله اول پروتئین ها با روش ایزو الکتریک فوکوسینگ جداسازی می شوند و سپس ژل در سدیم دو دسیل سولفات غوطه ور می شود و ۹۰ درجه چرخانده می شود. پس از اقدامات مرحله دوم الکتروفورز انجام می شود. در این مرحله پروتئین ها بر اساس اندازه جدا می شود. با این روش می توان چندین هزار پروتئین را در یک ژل جدا کرد.

بعد از الکتروفورز، با رنگ کردن ژل یک الگو پیچیده از نقطه ها بدست می آید که هر یک از این نقطه ها نشان دهنده ی پروتئین های متفاوتی است. زمانی که دو ژل با هم مقایسه می شود، تفاوت در الگو و شدت نقطه ها به تفاوت در ماهیت و مقدار نسبی پروتئین های خاص در دو پروتئوم مورد مطالعه اشاره دارد. بنابراین نقطه های مورد نظر را می توان برای مراحل بعدی جدا کرد و ماهیت واقعی پروتئین آن ها را تعیین کرد.

شناسایی پروتئین های مورد نظر بعد از جداسازی

دومین مرحله از پروفایلینگ پروتئین، شناسایی پروتئین های مورد نظر جدا شده از مخلوط اولیه می باشد. در ابتدا این مرحله مشکلاتی داشتند، اما روش انگشت نگاری جرمی پپتیدی فرایند شناسایی صحیح و سریعی را فراهم کرده است.

انگشت نگاری جرمی پپتیدی با پیشرفت هایی در طیف سنجی جرمی امکان پذیر شده است. طیف سنجی جرمی در اصل به عنوان یک وسیله جهت شناسایی یک ترکیب از نسبت جرم به بار اشکال یونیزه شده آن ها که با در معرض قرار گرفتن مولکول های آن ترکیب به یک منبع پر انرژی تولید شده اند، طراحی شده است. متاسفانه روش استاندارد را نمی توان برای پروتئین ها به کار برد چون که پروتئین ها خیلی بزرگ هستند و به طور موثر یونیزه نمی شوند، اما با روش MALDI-TOF می توان حداقل برای پپتید هایی به طول ۵۰ اسیدآمینه بر این مشکل فایق آمد. البته اکثر پروتئین ها  دارای اندازه ای بیشتر از ۵۰ اسیدآمینه هستند، بنابراین برای بررسی آن ها با روش  MALDI-TOF باید آن ها را به قطعات کوچکتر شکست. روش معمول این است که پروتئین ها را با یک پروتئاز خاص مثل تریپسین (که پروتئین ها را بعد از باقی مانده های آرژنین و لیزین برش می دهد) برش دهیم. اکثر پروتئین ها با این روش به پپتیدهایی به طول ۵-۷۵ اسیدآمینه شکسته می شوند.

وقتی پروتئین ها یونیزه شدند، نسبت جرم به بار یک پپتید بر اساس زمان گریز آن در طیف سنجی جرمی، زمانی که پپتید از منبع یونیزاسیون به سمت آشکارساز عبور می کند، تعیین می شود. با محاسبه تعیین نسبت جرم به بار می توان جرم مولکولی پپتید را تعیین کرد، بدین ترتیب می توان از روی جرم مولکولی ترکیب آمینواسیدی پپتید را نیز بدست آورد. اگر تعدادی از پپتید های پروتئین خاصی که روش ژل-الکتروفورز دو بعدی بدست آمده است، آنالیز و تجزیه و تحلیل شدند، می توان اطلاعات بدست آمده را با توالی ژنوم به جهت شناسایی ژن مخصوص و کد کننده آن پروتئین مرتبط ساخت.

اگر دو پروتئوم با هم مقایسه شوند، شرط و نکته کلیدی شناسایی پروتئین هایی است که مقدارهای متفاوتی وجود دارند. اگر این تفاوت نسبتا بزرگ باشد، این تفاوت را به سادگی و با نگاه کردن ژل های رنگ آمیزی شده بعد از الکتروفورز دو بعدی مشاهده خواهید کرد، اما تغییرات مهم در ویژگی های بیوشیمیایی یک پروتئوم می تواند منجر به تغییراتی در مقدار پروتئین های خاصی شود، بنابراین وجود روش هایی برای شناسایی کردن این تغییرات کوچک ضروری می باشد. یک راه حل ممکن این است که اجزای هر یک از پروتئوم ها را با نشانگرهای فلورسانس متفاوتی نشاندار کرد و سپس آن ها را با هم در یک ژل دو بعدی واحدی الکتروفورز کرد. آشکارسازی ژل دوبعدی در طول موج های متفاوت، تعیین شدت و چگالی نقطه های برابر را نسبت به زمانی که آن ها را روی دو ژل جداگانه الکتروفورز می کنند، آسان تر می کند.

روش صحیح تر، نشاندار کردن پروتئوم با ICAT می باشد. این نشانگرها را می توان به دو شکل بدست آورد، یکی از آن ها دارای اتم های طبیعی هیدروژن و دیگری دارای دئوتریوم (ایزوتوپ سنگین هیدروژن) است. نوع سنگین و طبیعی آن ها را می توان با طیف سنجی جرمی تشخیص داد، به طوری که می توان مقدار نسبی یک پروتئین را در دو پروتئومی که با هم مخلوط شده اند، در مرحله  MALDI-TOF فرآیند پروفایلینگ پروتئین بدست آورد.

مبحث مطالعه ژنوم

مطالعه ژنوم – پروتئوم(Proteome)

مطالعه ژنوم – ترانسکریپتوم(Transcriptome)