کلونینگ ژن و آنالیز DNA در پزشکی – بخش اول

پزشکی یک شاخه ی ذینفع مهم از انقلاب نوترکیبی بوده است و خواهد بود. در ادامه می بینیم که چگونه از تکنیک های نوترکیبی DNA برای تشخیص ژن های مسئول بیماری های ارثی و طراحی روش های درمانی جدید برای این اختلالات، استفاده می شود. روش هایی را که در آن ژن های کلون شده برای تولید داروهای نوترکیب به کارمی روند، بررسی می کنیم.

تولید داروهای نوترکیب

ریشه ی بسیاری از بیماری های انسانی فقدان یا اختلال در عملکرد یک پروتئین است که به طور طبیعی در بدن ساخته نمی شود. اکثر این بیماری ها را می توان با تجویز شکل طبیعی پروتئین به بیمار درمان کرد، اما برای اینکه این روش درمانی امکان پذیر باشد، باید شکل طبیعی پروتئین مورد نظر در مقیاس بالایی در دسترس باشد. اگر این نقص به کمک تجویز پروتئین های انسانی تصحیح شود، آنگاه بدست آوردن مقادیر کافی از پروتئین مورد نظر، یک مشکل بزرگ خواهد بود، مگر اینکه از خون اهدایی به عنوان منبع پروتئین استفاده کنیم. بنابراین از پروتئین های حیوانی در هر مورد که موثر باشند می توان استفاده کرد. اما تعداد بیماری هایی که با پروتئین حیوانی درمان می شوند، خیلی زیاد نیست و همچنین همیشه امکان بروز عوارض جانبی مانند پاسخ آلرژیک در اثر مصرف پروتئین های حیوانی وجود دارد.

انسولین نوترکیب

انسولین که توسط سلول های β جزایر لانگرهانس پانکراس ساخته می شود، سطح گلوکز را در خون کنترل می کند. نقص در انسولین باعث بروز دیابت ملیتوس می شود، که مجموعه ای از علائمی ست که اگر درمان نشود، منجر به مرگ بیمار می شود .

 

انسولین دارای دو ویژگی است که سبب تسهیل تولید آن از طریق تکنولوژی DNA نوترکیب می شود:

  1. انسولین انسانی بعد از ترجمه دچار هیچ تغییری مانند اضافه کردن ریشه قندی نمی شود، بنابراین امکان ساخته شدن انسولین توسط باکتری ها وجود دارد.
  2. اندازه مولکولی انسولین که یک پروتئین کوچک است و شامل دو پلی پپتید است.

در انسان این زنجیرها بصورت یک پیش سازه پره پروانسولین ساخته می شود که شامل قطعات A و B است که توسط یک زنجیره ی دیگر(زنجیره C) به هم وصل شده اند و در ابتدای این پیش ساز هم یک توالی وجود دارد. بعد از ترجمه توالی پیشرو حذف می شود و زنجیره ی C نیز برش می خورد و در نهایت پلی پپتیدهای A و B باقی می مانند که بوسیله ی دو باند دی سولفیدی به هم متصل شده اند.

چندین استراتژی برای بدست آوردن انسولین نوترکیب به کار بسته شده است. اولین پروژه شامل ساخت ژن های مصنوعی زنجیره های A و B و اتصال دو زنجیره در سلول E.coli بود که این کار همان تکنیک های عمومی به کار رفته در تولید پروتئین نوترکیب است.

فرآیند ساخت انسولین نوترکیب از ژن های مصنوعی زنجیربرای

ساخت و بیان ژن های مصنوعی انسولین

در اواخر دهه ی 1970، ایده ی ساخت یک ژن مصنوعی بسیار نوآورانه بود. در آن زمان ساخت الیگونوکلئوتیدها در دوران ابتدایی خویش به سر می برد و روش های در دسترسی که با آنها بتوان مولکول های DNA مصنوعی را بسازیم بسیار مشکل تر از تکینک های اتوماتیک امروزی بود. با این وجود، ژنی که زنجیره های A وb انسولین را کد کند، در سال 1978 ساخته شد. در این فرایند توالی های سه نوکلئوتیدی ساخته شد که نماینده ی همه ی کدون های ممکن بودند و این توالی ها بر اساس زنجیره های A و B به هم متصل شدند. این ژن مصنوعی لزوماً دارای همان توالی نوکلئوتیدی ژن های واقعی زنجیره های A وb نبود، اما توانست باعث تولید پلی پپتید صحیح شود. دو پلاسمید نوترکیب یکی حامل ژن مصنوعی زنجیره ی A و یکی حامل زنجیره ی B ساخته شد.

ژن مصنوعی هر زنجیره را به یک قالب باز خواندن LacZ’ در وکتور Pbr322 متصل کردند. بنابراین ژن انسولین، تحت کنترل پروموتر قوی Lac قرار می گرفت و درنتیجه ژن به صورت یک پروتئین همجوش بیان می شد که شامل چند اسیدآمینه ی اول ژن بتاگالاکتوزیداز و پلی پپتیدهای A وb بود. هر ژن طوری طراحی شده بود که بین قسمت بتاگالاکتوزیداز و قسمت انسولین یک زائده ی متیونین قرار بگیرد که بدین وسیله پلی پپتید انسولین را بتوان از قطعه ی بتاگالاکتوزیداز به کمک آنزیم سیانوژن برمید برش داد. سپس زنجیره های A و B را تخلیص کرده و در آزمایشگاه از طریق باند دی سولفیدی به هم متصل کردند.

مرحله ی نهایی یعنی تشکیل باندهای دی سولفیدی نسبتاً ناکارآمد است. در یک روش پیشرفته تر محققین چارچوب کامل خواندن پره انسولین که شامل زنجیره ی A، زنجیره ی C و زنجیره ی B بود را ساختند. گرچه ساختن DNA به این روش بسیار سخت تر است اما دارای این مزیت خواهد بود که در آن پره هورمون به طور خودبه خود دچار تاخوردگی می شود و ساختار باندهای دی سولفیدی صحیح خود را بدست می آورد. زنجیره های C را هم در نهایت می توان با یک برش پروتئولیتیک جدا کرد.

 

فرآیند تولید سوماتوستاتین نوترکیب

سنتز هورمون های رشد انسانی در E.coli

همان زمانی که انسولین نوترکیب برای اولین بار در E.coli ساخته شد، دانشمندان دیگری روی پروژه ای مشابه برای تولید هورمون رشد سوماتواستاتین و سوماتوتروپین، مطالعه می کردند. این دو پروتئین به همراه هم در کنترل پروسه ی رشد بدن انسان دخالت دارند و نقص در عملکرد آنها منجر به اختلالات دردناک و ناتوان کننده ای مانند آکرومگالی (رشد کنترل نشده ی استخوان) و کوتولگی می شود.

سوماتواستاتین اولین پروتئین انسانی بود که در E.coli تولید شد. این پروتئین به خاطر اینکه بسیار کوچک است و فقط 14 اسیدآمینه دارد، ساخت ژن مصنوعی آن بسیار آسان است. استراتژی که برای ساخت آن استفاده شد شبیه همان بود که برای تولید انسولین نوترکیب استفاده شد، یعنی داخل کردن ژن مصنوعی درون وکتور LacZ’ و ساخت یک پروتئین همجوش و سپس برش آن به وسیله ی سیانوژن برمید.

ساختن سوماتوتروپین کمی مشکل تر بود زیرا این پروتئین دارای 191 اسیدآمینه است که معادل تقریباً 600 جفت باز خواهد بود. بنابراین ساخت این DNA در اواخر دهه ی 1970 تقریباً غیرممکن به نظر می رسید. برای ساخت سوماتوتروپین نوترکیب از مجموعه ای از روش های ساخت ژن مصنوعی و کلونینگ DNA مکمل استفاده شد تا سویه ای از E.coli تولید کننده ی سوماتوتروپین بدست آید. mRNA از هیپوفیز(غده ای که سوماتوتروپین را در بدن تولید می کند) استخراج شد و کتابخانه ی cDNA سوماتوتروپین دارای یک جایگاه آنزیم محدودالاثر Hae III که می توانست cDNA را به دو قسمت برش دهد. قسمت بزرگ تر شامل کدون های 24 تا 191 بود که برای ساخت پلاسمید نوترکیب استفاده می شد و قسمت کوچکتر توسط یک مولکول DNA مصنوعی جایگزین شد که شامل ناحیه ی شروع ژن  سوماتوتروپین بود و باعث فراهم شدن یک سیگنال صحیح برای ترجمه در E.coli می شد و سپس ژن تغییریافته را وارد یک وکتور بیانی کردندکه حامل پروموتر Lac بود.

 

 

کلونینگ ژن و آنالیز DNA در پزشکی – بخش اول

کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در پزشکی – بخش دوم

کلونینگ ژن و آنالیز DNA در پزشکی – بخش سوم

کلونینگ ژن و آنالیز DNA در پزشکی – بخش چهارم

کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در پزشکی – بخش پنجم

کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در پزشکی – بخش ششم 

 

درباره نویسنده:

کارگروه تولید محتوا
اولین قدم برای طی کردن هر مسیر بلند و موثری آگاهی بخشی و اطلاع رسانی به افراد همراه در آن مسیر می باشد. کارگروه تولید محتوا با هدف آموزش صحیح و پله پله، ایجاد فضای یادگیری و گفتگو در اتمسفر آزمایشگاهی کشور و اطلاع رسانی در مورد نیاز های کشور در حوزه ی زیست شناسی با نیم نگاهی به فعالیت های روز دنیا، سعی در ایجاد دیدی روشن و وسیع در حوزه ی تخصصی مخاطبین خود دارد.

نوشتن دیدگاه