همراهان همیشگی دنیای مولکولی داروینو، در این مطلب قصد داریم شما را با یکی از روش های نوین PCR تحت عنوان Digital PCR یا dPCR که یک روش دقیق با حساسیت بالا جهت تعیین میزان DNA و RNA موجود در نمونه می باشد، آشنا کنیم.

در این روش از نظر مواد اولیه و مرحله تکثیر اسید نوکلئیک ها مشابه qPCR یا همان Real Time PCR می باشد، یعنی از شیوه های تشخیصی بر مبنای پروب های فلوئورسنت و روش تکثیر PCR استاندارد استفاده می شود و تنها تفاوت در این است که، در این روش میزان قطعی نوکلئیک اسیدها ی نمونه مورد نظر، بدون  نیاز به منحنی استاندارد و رفرنس ها به دست می آید

 

در تکنیک qPCR سیگنال های آزاد شده از توالی های نادر مثل جهش های نقطه ای از سیگنال های آزاد شده از توالی طبیعی قابل تشخیص نیست چون توسط آن ها پوشانده می شود ولی حساسیت در  روش dPCR به  گونه ای است که توالی های نادر هم  در میان حجم زیادی از توالی طبیعی می توان تشخیص داد .

 

این تکنیک نخستین بار در سال 1992 توسط skyes و همکارانش معرفی شد، آن ها با انجام یک آزمایش PCR دو مرحله ای ژن جهش یافته زنجیره سنگین ایمونوگلوبولین در یک کلون لوسمیک را از بین تعداد زیادی لنفوسیت طبیعی تشخیص دادند که تعیین این میزان دقیق با استفاده از limiting dilution و توزیع پواسون انجام گرفت.

سپس در سال 1997، kalinina و همکارانش تنها یک توالی DNA  در میان کل ژنوم با استفاده از PCR ساده شناسایی کردند که این روش در مقیاس نانولیتر با استفاده از پروب های TaqMan و لوله های مویین انجام شد.

در سال 1999 ، Vogelstein و Kinzler  با روش های قبلی نسخه جدیدی از این تکنیک را با پلیتی با 96 چاهک ارائه دادند و واژه Digital PCR  را برای اولین بار به کار بردند. آن ها نمونه های مورد بررسی را به قدری رقیق کردند که در هر  دو چاهک تنها یک نمونه الگو قرار بگیرد و سپس از پروب های فلوئورسنت لیبل شده شناسایی صورت گرفت.

ولی این سیستم ها خیلی دشوار بودند و بررسی حجم زیادی از نمونه با آن ها میسر نبود  و مدت زمان زیادی لازم داشتند، بنابراین برای انجام آنالیز های پیچیده،  Emulsion PCR ، چیپ های microfluid و microarray ها توسعه یافتند.

 

در تکنیک Digital PCR (dPCR) نمونه DNA مورد نظر به طور پی در پی رقیق می شود و پس از آن بین تعداد زیادی از ظرف های واکنش که حاوی مواد اولیه مشابه مواد اولیه واکنش در  Real Time PCR هم چون پرایمر ها، پروب های فلوئورسنت و…هستند تقسیم بندی می گردد.

سپس واکنش PCR عادی به طور کامل در ترمال سایکلر انجام می گیرد و در نهایت واکنش هایی که سیگنال فلوئورسنت دارند مثبت  گفته می شوند و با شماره 1 نشان داده می شوند و واکنش هایی که فقط سیگنال پیش زمینه را دارند با 0 شماره گذاری می شوند و با استفاده از فرمولی به نام توزیع پواسون غلظت مولکول های هدف به طور دقیق معین می شوند.

 

امروز دستگاه های زیادی جهت Digital PCR توسط کمپانی های مختلف به بازار عرضه می شوند ولی اساس کار همه ی آن ها یکی است .

یکی از معروف ترین دستگاه ها جهت این تکنیک Thermo Fisher scientific’s QuantStudio 12k Flex  می باشد.

 

تکنیک Droplet Digital PCR نیز یک نوع dPCR  می باشد که برای دسترسی به دقت بسیار بالا، درون هزاران قطره با اندازه نانولیتر انجام می شود و نمونه مورد نظر در حدی رقیق می شود که درون هر قطره یا هیچ یا یک مولکول DNA قرار بگیرد سپس مواد مورد نیاز واکنش مثل پروب های TaqMan تشخیصی جهت آلل های مختلف مورد بررسی و سایر واکنشگر های لازم اضافه می شوند. و پس از PCR میزان فلورسانس در هر قطره اندازه گیری می شود و در نهایت هم تعداد قطره ها جهت تشخیص سیگنال های مربوط به آلل های طبیعی و جهش یافته شمارش می شود. و از مزایای این تکنیک این هست که به دلیل حساسیت و دقت بسیار بالایی که دارد جهش های بسیار نادر هم چون  حالت موزائیک یا جهش های سوماتیک اکتسابی یا جهش های پدری در حالت بررسی جهش های وراثتی در DNAجنینی آزاد در خون مادر، به وجود بیاورد.

 

در این مطلب یکی از انواع PCR برای شما عزیزان گفته شد برای یادگیری تکنیک های مولکولی بیشتر با داروینو همراه باشید.