✍ ‌‌‌‌‌روش انجام کشت در محیط سطح شیبد‌‌ار

‌‌‌‌۱. مقداری از کلونی باکتریایی را با اپلیکاتور، آنس یا لوپ برداشته و با یک قطره سالین یا آب مقطر استریل بر روی لام مخلوط کنید، تا سوسپانسیون یکنواختی حاصل گردد. اسمیر را در مجاورت هوا خشک کنید. سپس به وسیله حرارت آن را فیکس کرده و رنگ آمیزی گرم انجام دهید.
۲. باکتری مورد نظر را به وسیله لوپ استریل خنک شده و به روش کشت خطی بر روی محیط Mac conkey و EMB تلقیح نموده و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید. پس از سپری شدن دوره انکوباسیون کلونی را از نظر مصرف لاکتوز بررسی کنید.
۳. در شرایط استریل و با استفاده از آنس نوک تیز(نیدل) عمق لوله TSI یا KIA را به صورت خط عمود و سطح شیبدار را بصورت زیگزاک کشت دهید. لوله ها را به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کرده و سپس نتیجه واکنش ها را بررسی کنید.
تصویر بالای صفحه روش انجام کشت در محیط سطح شیبدار را نشان می دهد

۴. باکتری را در محیط اندول کشت داده و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید. پس از سپری شدن دوره انکوباسیون چند قطره معرف کواکس به محیط اضافه کنید. پیدایش حلقه قرمز رنگ بیانگر تولید اندول و مثبت بودن تست است.
۵. در شرایط استریل یک لوپ از باکتری را به درون محیط MR-VP Broth تلقیح نموده و به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه نگهداری کنید. پس از زمان انکوباسیون ۱/۳ محیط تلقیح شده را به لوله آزمایش خالی انتقال داده و برای تست VP کنار بگذارید. به ۲/۳ باقیمانده محیط کشت ۰/۲ میلی لیتر (حدود ۴ تا ۵ قطره) معرف متیل رد ریخته و از نظر MR بررسی کنید. مشاهده رنگ قرمز، مثبت شدن تست متیل رد را نشان می دهد.
۶. به محیط تلقیح شده MR-VP Broth که به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه انکوبه شده است، به میزان ۰/۶ میلی لیتر آلفا نفتول و سپس ۰/۲ میلی لیتر محلول هیدروکسید پتاسیم با غلظت ۴۰ درصد اضافه نمایید. نمونه را به خوبی مخلوط کرده و برای مدت ۱۵ دقیقه در حرارت اتاق قرار دهید. ظهور رنگ قرمز در محیط نشان دهنده حضور استوئین و مثبت بودن VP است.
۷. در شرایط استریل باکتری را به روش کشت سطحی و عمقی در محیط سیمون سیترات آگار تلقیح کنید، سپس لوله های کشت را به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری نموده، پس از دوره انکوباسیون مشاهده هرگونه تغییر رنگ از سبز به آبی نشانه مثبت بودن تست سیترات است.
۸. باکتری مورد نظر را در محیط کشت مایع حاوی نیترات (۱ درصد KNO3) تلقیح نموده و به مدت ۲۴ ساعت در دما ی۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید. سپس حجم مساوی از اسید سولفانیلیک و آلفا نفتیل آمین را با هم مخلوط کرده و ۰/۱ میلی لیتر از این معرف را به محیط کشت اضافه کنید. ایجاد رنگ قرمز در عرض ۱ تا ۳ دقیقه نشانه احیای نیترات به نیتریت می باشد و تست مثبت تلقی می گردد.
۹. از باکتری مورد نظر در دو لوله مولر دکربوکسیلاز(یک لوله حاوی اسیدامینه و لوله دیگر فاقد اسیدامینه به عنوان لوله کنترل) تلقیح کنید. در هر لوله روی محیط کشت را با روغن استریل (حدود ۱ سانتیمتر) بپوشانید. لوله ها را به مدت ۴ روز در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید ولی تغییر رنگ آنها را روزانه بررسی نمایید. تغییر رنگ زرد در اندیکاتور برموکرزول پورپول در لوله در کنترل، بیانگر زنده بودن ارگانیسم و توانایی آن در تخمیر قندها می باشد که در اثر تخمیر گلوکز، PH محیط اسیدی شده و برای عملکرد آنزیم دکربوکسیلاز شرایط فراهم شده است. در طی مراحل ابتدایی انکوباسیون، هر دو لوله زرد می شوند که به دلیل تخمیر مقدار کم گلوکز در محیط کشت است. اگر اسیدامینه مصرف شود رنگ محیط حاوی اسیدامینه به رنگ اولیه خود(بنفش) برمیگردد. اگر اسیدامینه مصرف نشود رنگ محیط زرد باقی می ماند، ایجاد رنگ خاکستری در بعضی مواقع به دلیل احیا شدن اندیکاتور می باشد.
۱۰. باکتری مورد آزمایش را در شرایط استریل به محیط کشت Urea Broth تلقیح نموده و به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید، سپس لوله های کشت را از نظر هیدرولیز اوره مورد بررسی قرار دهید. مشاهده رنگ صورتی پررنگ یا ارغوانی نشانه مثبت شدن تست اوره آز است.

نکات مهم در حین انجام آزمایش

۱. در کشت TSI یا KIA دقت کنید که هنگام بیرون آوردن نیدل از ته لوله شکستگی در محیط جامد ایجاد نشود، زیرا ممکن است این ترک با تولید گاز توسط باکتری اشتباه شود.
۲. درب لوله های کشت TSI و KIA را پس از تلقیح سفت نبندید، شل بستن درب لوله و تبادل هوا باعث بالا بردن شرایط قلیایی در سطح شیب دار می شود، زیرا اگر در پیچ لوله محکم بسته شود، یک واکنش اسیدی که فقط با تخمیر گلوکز ایجاد شده، سطح شیب دار را نیز در بر می گیرد.
۳. در صورتیکه ته لوله سیاه رنگ شود(در نتیجه تولید H2S) و رنگ قرمز یا زرد آن مشخص نباشد، آن را به عنوان رنگ زرد (اسیدی) در نظر بگیرید.
۴. به منظور دستیابی به نتایج صحیح، لوله TSI را طی ۱۸ تا ۲۴ ساعت پس از انکوباسیون مور بررسی قرار دهید، زیرا در طی این فاصله زمانی هرگز سوبسترای قندی باکتری تمام نشده و باکتری برای تامین انرژی خود از پیتون ها استفاده نکرده است.
۵. برخی از ارگانیسم ها ممکن است تولید سولفید هیدروژن را روی KIA نشان دهند، اما روی TSI نشان ندهند، چون استفاده از ساکارز در محیط TSI فعالیت آنزیمی را که در تولید H2S اثر می گذارند را مهار می کند. بویژه سالمونلای تولید کننده H2S و بعضی از اعضاء انتروباکتریاسه نمی توانند روی محیط TSI تولید H2S نمایند.
۶. سولفات آهن موجود در محیط TSI گاهی دارای حساسیت کمتری نسبت به سایر نمک های فریک می باشد. بنابراین ممکن است در ایجاد H2S در TSI و KIA با سایر محیط های کشت مثل SIM مغایرت هایی دیده شود.
۷. بعضی سویه ها نظیر باکتری های غیر تخمیری به مدت انکوباسیون طولانی ۷ تا ۱۴ روز نیاز دارند. جهت تسریع در کار می توان از مقدار کمی محیط کشت همراه با تلقیح مقدار زیاد باکتری استفاده کرد.
۸. عده ای معتقدند استفاده از محیط لیزین براث نسبت به محیط مولر دکربوکسیلاز ارجح است. زیرا در محیط لیزین براث فقط به قلیایی شدن و تغییر رنگ اندیکاتور PH نیاز است.(نه به شرایط هوازی یا محیط اسیدی) اما این محیط نمی تواند برای بعضی از باکتری ها مثل کلبسیلا، انتروباکتر، سراشیا و هافنیا استفاده شود. زیرا این باکتری ها استیل متیل کربونیل تولید می کنند که با PH قلیایی نهایی تداخل کرده و واکنش منفی کاذب می دهد.
۹. در آزمایش متیل رد به دلیل تخمیر آهسته برخی باکتری ها محیط کشت را به مدت ۴ تا ۵ روز تحت نظر قرار دهید

 باکتری های خانواده انتروباکتریاسه

تست های مهم گروه باکتریایی انتروباکتریاسه – بخش اول

تست های مهم گروه باکتریایی انتروباکتریاسه – بخش دوم

آزمایش TSI برای شناسایی اعضای خانواده انتروباکتریاسه