✍ روش های تعیین هویت سلول ها در آزمایشگاه های سلولی

 یکی از مهمترین اهدافی که ما بخاطر آن سلول ها را کشت و بعد از آن پاساژ می دهیم، خالص سازی یک تیره ی سلولی مشخص است. این مسئله آنقدر مهم است که اگر یک تیره ی دیگر بین سلول های ما رشد کنند ما رشد آنها را یک نوع آلودگی cross) contamination) به حساب می آوریم. برای اینکه متوجه و مطمئن شویم که سلول ها همگی از همان تیره ی مورد نظر هستند، لازم است که هویت سلول ها را بررسی کنیم.

تکنیکهای مختلفی برای تشخیص در آزمایشگاه های کشت سلول وجود دارد، مثل: بررسی های ایزوآنزیمی، سیتوژنتیکی، کاریوتایپ و بررسی آنتی ژن های سطحی سلول ها. هر آزمایشگاه بسته به نوع امکاناتی که دارد یکی از این روش ها را انتخاب می کند و البته این تکنیک ها، روش های عمومی برای تشخیص همه ی تیره های سلولی هستند و برای انجام پروژه های خاص تر طبیعتا لازم است که از تکنیک های اختصاصی تر هم استفاده کرد. تعیین هویت سلول مطلب مهمی است و می شود گفت روش محک زدن موفق بودنمان در انجام کشت و پاساژ سلول و همینطور به درستی به مقصد رساندن پروژه است.

تکنیک  بررسی کروموزوم ها (کاریوتایپ)

همانطور که می دانید کاریوتایپ گونه های مختلف موجودات کاملا باهم دیگر متفاوت است و از این تفاوت می شود برای تعیین هویت تیره های سلولی استفاده کرد. برای بررسی کروموزوم ها باید سلول ها در مرحله ی متافاز میتوز متوقف شوند.

دستورالعمل/ روش کار تکنیک بررسی کروموزوم ها (کاریوتایپ)

۱-ابتدا به ازای هرسانتی متر مربع فلاسک حدود ۵ تا ۱۰ هزارتا سلول کشت می دهیم.

۲- مدت ۳ تا ۵ روز بعد از کشت، یعنی درست زمانی که سلول ها در فاز رشد لگاریتمی شان هستند، به آنها کلشی سین یا کلسماید(با غلظت یک ده میلیونیوم مولار) اضافه می کنیم. این ماده از تشکیل دوک تقسیم جلوگیری می کند باعث توقف سلولها در مرحله ی متافاز می شود. بعد از ۴ تا ۶ ساعت محیط رویی سلول ها را دور می ریزیم و سلول ها را به کمک تریپسین ۰/۲۵ درصد از فلاسک جدا می کنیم، شستشو می دهیم. دوباره مایع رویی را دور می ریزیم و به رسوب سلولی ۵ میلی لیتر محلول هیپوتونیک حاوی ۰/۰۴ مولار کلرید پتاسیم و ۰/۰۲۵ مولار سیترات سدیم می ریزیم و برای ۲۰ دقیقه آن را انکوبه می کنیم تا غشاء سلول ها پاره شوند و کروموزوم ها آزاد شود.

۳-حالا نوبت این است که به این سوسپانسیون ۵ میلی لیتر محلول اسید الکل سرد (حاوی یک حجم اسید استیک گلاسیال و سه حجم متانول) اضافه کنیم. این کار برای فیکس کروموزومها انجام می شود. لوله را برای ۲ دقیقه سانتریفیوژ می کنیم. مایع رویی را دور می ریزیم و دوباره به رسوب باقی مانده محلول اسید الکل اضافه می کنیم و بعد از مخلوط کردنش، برای ۱۰ دقیقه روی یخ قرار می دهیم. لوله را دوباره برای ۲ دقیقه سانتریفیوژ می کنیم و مایع رویی را دور می ریزیم و از رسوبش لام تهیه و خشک می کنیم.

• نکته مهم این است که باید حواسمان باشد کروموزوم ها بصورت یکنواخت روی لام پخش شوند و روی هم نیوفتند. پس اگر نمونه غلیظ بود آن را رقیق می کنیم و دوباره از آن لام تهیه می کنیم. برای بررسی تعداد کروموزوم ها کافی ست لام ها با گیمسا رنگ آمیزی شوند با محلول مانت و لامل بپوشانیم و با میکروسکوپ نوری بررسی کنیم.
• اگر بخواهیم نمونه بیشتر مطالعه و بررسی کنیم می توانیم از تکنیک های ایجاد باند روی کروموزوم ها استفاده کنیم.

برای ایجاد باند با گیمسا (G-Banding)، باید کروموزوم ها را درمعرض تریپسین قرار دهیم تا بعضی از پروتئین های آن تجزیه شود.اینطور بعد از رنگ آمیزی با گیمسا کروموزومها حالت باند باند به خودشان می گیرند که تعداد این باند ها قابل شمارش است و وجه تشخیصی دارد.

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش اول

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش دوم

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش سوم