✍ کاربرد تکنیک جداسازی و کشت فیبروبلاست جنینی موش در آزمایشگاه های سلولی

جداسازی و کشت فیبروبلاست جنینی موشی یکی از پایه ای ترین و اساسی ترین بخش های آزمایشات کشت سلولی است. آماده سازی فیبروبلاست جنینی موشی مناسب برای کشت سلول های بنیادی جنین انسانی (Human  Embryonic Stem Cell) و سلول های بنیادی پرتوان القایی (Induced Pluripotent Stem Cell) کیفیت فیبروبلاست های جنینی موشی (MEF) ها توسط سویه موشی مانند CF-1 شناسایی شده است. MEF ها و مواد مغذی که از آنها ترشح شده و به علاوه محیط رویی که از روی سلول های فیبروبلاست جمع آوری می شود، باید حاوی غلظت های مطلوب Activin A، Gremlin و Tgfβ۱ مورد نیاز برای مسیرهای Activin / Nodal و FGF  باشند تا بتوانند خود نوزایی (self-renewal) و پرتوانی سلول های بنیادی را حفظ کنند.

به طور کلی، سلول های بنیادی جنینی انسانی (hESCs) و سلول های بنیادی پرتوان القایی انسانی (hiPSCs) می توانند تحت شرایط متغیری کشت داده شوند. با این حال، ایجاد یک سیستم موثر برای کشت این سلول ها آسان نیست. از آنجا که شرایط کشت سلول می تواند بر بیان ژن تاثیر گذار باشد، درسلول های hESC ها و hiPSC ها ، بهینه سازی و استاندارد سازی روش کشت بسیار مهم است.

کشت لاین های سلولی hESC ابتدا با استفاده از MEF ها به عنوان سلول های غذا دهنده (Feeder) و سرم جنین گاوی (FBS) که حاوی محیطی مناسب برای کشت توصیف شده است، انجام می گیرد. سپس، FBS با سرم (KSR) و FGF2 جایگزین شده، که باعث افزایش تکثیر hESCs می شود. در نهایت، سیستم های کشت بدون(Feeder) که سلول ها می توانند بر روی پلیت کشت پوشیده شده از ماتریژل قرار بگیرند و محیط  کاندیشن شده محتوی سرم (KSR) محیط  کاندیشن شده به واسطه (MEF) انتقال داده شوند. پس از آن، شرایط کشت hESCs به سمت محیط های بدون Feeder و محیط های کاندیشن شده شیمیایی با غلظت مشخص پیش برده می شود. نکته مهم این است که شواهدی مبنی بر تفاوت در فاکتور های رشد تولید شده در سلولهای feeder انسانی و موشی وجود دارد. تجزیه و تحلیل از transcriptomes سلول های Feeder موشی و انسانی نشان داد که تفاوت های قابل توجهی بین سلول های حمایتی و غیر حامی وجود دارد. Exogenous FGF2 برای حفظ خود نوزایی hESCs و hiPSCs بسیار مهم است و به عنوان عامل کلیدی تنظیم بیان Tgfβ۱، Activin A و Gremlin آنتاگونیست(BMP) در سلول های فیدر شناسایی شده است. نشان داده شده است که Activin A بیان OCT4،  SOX2 و NANOG را در hESCs15-16 القا می کند.

برای کشت طولانی مدت،hESC ها و hiPSC ها می توانند بر روی MEF هایی که تکثیرشان متوقف شده یا تحت شرایط بدون فیدر(Feeder-free conditions)در MEF-CM(MEF-Conditioned Medium) بر روی پلیت های پوشیده شده با Matrigel رشد کنند تا حالت بدون تمایز آنها حفظ شود و به اصطلاح Stemness آنها تا حد زیادی نگه داشته شود. موفقیت هر دو شرایط کشت به طور کامل بستگی به کیفیت سلولهای فیدر دارد، زیرا آنها به طور مستقیم بر رشد hESC ها تاثیر می گذارند.

تصویر بالای صفحه مورفولوژی تیپیک سلول های hESCs و hiPSCs کشت داده شده را نشان می دهد.

پروتکل/ دستورالعمل روش بهینه جهت جداسازی و کشت فیبروبلاست های جنینی موشی

• ابتدا یک موش باردار را با روش هایی که در هر آزمایشگاه استاندارد شده می کشیم.
• انسداد دهانه ی رحمی و با اتانول ۷۰% و با PBS+ شستشو داده می شود.
• تمامی مراحل بعدی در زیر هود و تحت شرایط آسپتیک و با استفاده از تجهیزات استریل انجام می گیرد.
• شاخ ها ی رحمی به داخل یک پلیت کشت انتقال داده می شود و جداسازی هر جنین از جفت خود و کیسه جنینی انجام می گیرد.
• اندام سر و اندام های قرمز را بشکنید و در PBS بشویید و همه جنین ها را در یک پلیت کشت تمیز قرار دهید. در نهایت بافت ها را با یک تیغ استریل خرد کنید تا امکان پیپت کردن فراهم شود.
• ۱ میلی لیتر از تریپسین ۰.۰۵% در هر جنین اضافه می کنیم.
• بافت را به یک فالکون ۵۰ انتقال دهید و به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه کنید، پس از هر ۵ دقیقه انکوباسیون، سلول ها را به وسیله پیپت کردن بالا و پایین ببرید تا کاملا از هم جدا شوند.
• آنزیم را با اضافه کردن ۱ میلی لیتر از محیط MEF آماده شده خنثی کنید. محیط کشت MEF(همه مواد با هم ترکیب شده و سپس فیلتر می شوند؛ ۴۵۰ml DMEM, 50ml FBS10%, 5ml L-glutamin, 5mlPenecillin-Streptomycin, )
• سپس سلول ها به آرامی سانتریفیوژ شده با سرعت کم(۳۰۰g) به مدت ۵ دقیقه و محیط رویی به آرامی برداشته می شود و پلت سلولی دوباره درمحیط MEF گرم حل می شود.
• به طور معمول در هر فلاسک T150 محتوی ۳ تا۴ جنین می باشد با استفاده از روش Preplate کردن (باعث شده فیبروبلاست ها که توانایی اتصال به پلیت های پوشیده شده با ژلاتین را دارند) به خوبی بچسبند.
• پس از گذشت ۲۴ ساعت که تراکم سلولی به ۸۰-۹۰% رسید که در این مرحله سلول ها پاساژ۰ محسوب می شوند و برای استفاده های بعدی فریز می شوند.

  مراحل جداسازی فیبروبلاست (MEF)

جداسازی و استخراج feeder ها برای کشت سلول ها و فراهم آوری محیط تغذیه ای مناسب برای تکثیر آنها بسیار مهم است علاوه بر آن مراحل انجام این جداسازی از حیوان باید با دقت بسیاری انجام گیرد.

 مورفولوژی معمول mouse embryonic fibroblasts (MEFs)