✍ پروتکل/دستورالعمل کشت باکتری های بی هوازی

باکتری های بی هوازی مهم از نظر پزشکی : باکتروئیدس فراژیلیس (عفونت خون)، کلستریدیوم ها و باکتروئیدس (عفونت روده ای)، اکتینومیستها، باکتروئیدس،فوزوباکتریوم و کلستریدیوم ها (عفونت دستگاه ژنیتال)، کلستریدیوم ها، باکتروئیدس و پیتواسترپتوکوکوس(عفونت پوست و بافت نرم)

اکسیژن یکی از فاکتورهای مهم و تاثیر گذار بر رشد میکروارگانیسم ها می باشد. میکروارگانیسم ها از نظر نیاز به اکسیژن بسیار متفاوتند. این تنوع به اختلاف در سیستم های آنزیمی مسیر اکسیداسیون –احیا در گونه های مختلف باکتریایی وابسته است. باکتری ها را از نظر نیاز به اکسیژن به پنج گروه اصلی تقسیم می کنند:

باکتری ها را از نظر نیاز به اکسیژن به پنج گروه اصلی تقسیم می کنند

باکتری های هوازی (Aerobes): این باکتری ها برای رشد به اکسیژن اتمسفری نیاز دارند و فقط در حضور اکسیژن رشد می کنند و اکسیژن را به عنوان پذیرنده الکترون مورد استفاده قرار می دهند.

باکتری های بی هوازی اختیاری(Facultative anaerobes): در حضور یا غیاب اکسیژن رشد می کنند در محیط هوازی از اکسیژن استفاده نموده و در شرایط بی هوازی از ترکیباتی مانند نیترات یا سولفات به عنوان گیرنده نهایی الکترون استفاده می کنند. همچنین می توانند از مسیر تخمیری برای تامین انرژی استفاده نمایند.

باکتری های بی هوازی تحمل کننده اکسیژن (Aerotolerant anaerobes): این باکتری ها از مسیر تخمیری انرژی مورد نیاز خود را تامین می کنند، اما برخلاف باکتری های بی هوازی اجباری، به دلیل داشتن آنزیم های کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز، حضور اکسیژن باعث مرگ آنها نمی شود و قادرند حضور اکسیژن را تحمل کنند.

باکتری های میکروائروفیل (Microaerophiles): این گروه از باکتری ها برای رشد به مقادیر بسیار کم اکسیژن نیاز دارند. مقادیر بالای اکسیژن باعث متوقف شدن فعالیت آنزیم های اکسیداتیو و در نتیجه مرگ باکتری خواهد شد.

باکتری های بی هوازی اجباری (Obligate anaerobes): باکتری های بی هوازی در حضور اکسیژن محصولات متابولیکی سمی مانند یون سوپراکسید (-O2) و پراکسید ( H2O2) تولید می کنند. این محصولات به واسطه آنزیم های کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز به آب و اکسیژن تولید می شوند ولی از آنجایی که باکتری های بی هوازی اجباری فاقد آنزیم های فوق می باشند مقادیر بسیار کم اکسیژن باعث مرگ باکتری می شود. بنابراین این دست از باکتری ها فقط در غیاب اکسیژن قادر به رشد هستند.

نیازمندی میکروارگانیسم ها به اکسیژن را می توان از طریق کشت مخلوط میکروب در لوله آزمایش تعیین نمود. برای این کار نمونه میکروبی مورد آزمایش را درون محیط کشت جامد ذوب شده ای تلقیح کرده، بلافاصله محیط کشت را سرد می کنند. به این ترتیب میکروب هایی که در تمام محیط کشت منتشر شده اند در محل خود باقی خواهند ماند. پس از انکوباسیون، الگوی رشد میکروارگانیسم  در محیط کشت، چگونگی نیازمندی آن به اکسیژن را نشان می دهد. باکتری های هوازی در سطح محیط کشت و انواع بی هوازی در عمق لوله رشد می کنند. باکتری های بی هوازی اختیاری به دلیل عدم وابستگی به اکسیژن در سراسر لوله رشد می نمایند و باکتری های میکروائروفیل در منطقه ای کمی پایین تر از سطح محیط کشت رشد خواهند کرد.

روش های کشت میکروارگانیسم های بی هوازی

کشت در محیط تیوگلیکولات ( Thioglycollate media):

یک محیط نیمه جامد است که در لوله های درب پیچدار تهیه می شود. تیوگلیکولات موجود در این محیط، ترکیب احیا کننده قوی است که با اکسیژن محیط ترکیب شده و شرایط بی هوازی ایجاد می کند. رنگ معمولی محیط تیوگلیکولات زرد کم رنگ است، اما زمانی که اکسیژن در آن حل شود به رنگ صورتی یا آبی کم رنگ تغییر خواهد یافت. زیرا در این محیط رنگ هایی مانند متیلن بلو یا رزازورین (Resazurin) وجود دارد که به عنوان معرف پتانسیل اکسیداسیون احیا عمل می کند. تغییر رنگ در قسمت بالای لوله مشاهده می شود، اگر عمقی بیش از ۱/۵ سانتیمتر از بالای لوله تغییر رنگ داده باشد، برای کشت بی هوازی مناسب نیست. در چنین حالتی درب پیچدار محیط کشت را کمی باز کرده و ده دقیقه درون بن ماری جوش قرار می دهند تا اکسیژن حل شده در محیط خارج گردد. به منظور تلقیح نمونه های بی هوازی باید اجازه دهید تا دمای محیط کاهش یابد و ترجیحا نمونه را به عمق لوله تلقیح نمائید.

کشت در جار بی هوازی (Anaerobic jar):

جار بی هوازی محفظه شیشه ای است که به روش های مختلف اکسیژن آن را تخلیه می کنند و شرایط را برای رشد باکتری های بی هوازی فراهم می سازند. حذف اکسیژن از محیط داخلی جار به دو طریق عمده صورت می گیرد:

الف- پمپ تخلیه : در این روش نوعی از جار بی هوازی به کار می رود که روی درب آن دو عدد شیر وجود دارد. یکی از شیر ها برای تخلیه گازهای درون جار به پمپ تخلیه متصل می شود و شیر دیگر برای اتصال به کپسول گاز ازت و دی اکسید کربن ( ۹۵ درصد ازت و ۵ درصد دی اکسید کربن) به کار می رود و این دو گاز را جایگزین هوای خارج شده می نماید.

ب- سیستم گازپک: در این روش به پاکت گازپک طبق دستورالعمل مندرج بر روی پاکت حجم مشخصی آب اضافه می شود. در اثر واکنش آب با ترکیبات موجود در پاکت، گاز های CO2 و H2 آزاد می شود. هیدروژن حاصل در مجاورت کاتالیزور پالادیوم با اکسیژن موجود ترکیب شده و آب تولید می گردد. به این ترتیب اکسیژن موجود در جار حذف شده و شرایط بی هوازی حاکم می شود. برای حصول اطمینان از شرایط بی هوازی سیستم، یک نوار کاغذی آغشته به محلول رنگی متیلن بلو را نیز در جار قرار می دهند. نوار آبی رنگ مذکور در غیاب اکسیژن بی رنگ می شود.

روش اسید پیروگالیک:

نمونه میکروبی را به طریق خطی در سطح محیط کشت نوترینت آگار شیبدار در لوله کشت داده و مقداری پنبه درون لوله وارد کرده تا در مجاورت سطح شیبدار قرار گیرد. فضای بالای پنبه را با بلورهای اسید پیروگالیک پر کرده و کمی هیدروکسید سدیم به آن اضافه می کنند. درب لوله را محکم بسته و آن را بصورت وارونه در انکوباتور قرار می دهند. مواد شیمیایی، اکسیژن درون لوله را جذب کرده و فضای بی هوازی ایجاد می کند.

روش استفاده از پارافین:

در این روش از هر نوع محیط کشتی که حاوی ترکیبات احیاء کننده مانند عصاره قلب و مغز، جگر گوساله، سیستئین یا اسید اسکوربیک باشد می توان استفاده کرد. محیط کشت را حرارت می دهند تا اکسیژن محلول در محیط خارج گردد، سپس آن را به سرعت سرد نموده و نمونه میکروبی را تلقیح می نمایند و حدود ۲ سانتیمتر پارافین ذوب شده روی محیط کشت مایع ریخته و درون انکوباتور قرار می دهند.

پروتکل/روش انجام آزمایش

الف: تعیین نیازمندی باکتری ها به اکسیژن

1. محیط کشت مغذی تهیه شده در لوله را در بن ماری جوش قرار دهید تا ذوب شود و اکسیژن محلول در محیط خارج گردد
2. محیط را تا دمای ۴۸ تا ۵۰ درجه سانتیگراد سرد کنید
3. مشخصات باکتری مورد آزمایش را بر روی لوله ثبت کنید
4. در شرایط استریل یک یا دو لوپ باکتری درون لوله تلقیح نمایید
5. لوله را در کف دست گرفته و با چرخاندن آن در بین دو دست، باکتری ها را در محیط پخش کنید
6. محیط را سرد کرده و به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه نگهداری کنید
7. نحوه رشد و توزیع باکتری را در سطح و عمق محیط بررسی کنید

ب: کشت در محیط تیوگلیکولات

1. مشخصات باکتری مورد آزمایش را بر روی لوله محیط کشت تیوگلیکولات ثبت کنید
2. نمونه باکتری را در شرایط استریل به عمق لوله تلقیح کنید. (این محیط حاوی متیلن بلو یا رزازورین بوده و در حضور اکسیژن به رنگ صورتی یا آبی کم رنگ تغییر رنگ می دهد. در چنین حالتی برای کشت مناسب نیست و باید مجددا در بن ماری حرارت ببیند تا اکسیژن محلول در آن خارج گردد.)
3. لوله های تلقیح شده را به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتگراد نگهداری کنید
4. پس از سپری شدن دوره انکوباسیون لوله ها را از نظر رشد میکروبی بررسی کنید

ج: کشت در جار بی هوازی

1. مشخصات باکتری مورد آزمایش را روی پلیت ثبت کنید
2. باکتری مورد نظر را در شرایط استریل روی پلیت مغذی تلقیح کنید
3. پلیت های تلقیح شده را درون جار بی هوازی قرار دهید
4. نوار آغشته به معرف اکسیداسیون احیاء (متیلن بلو) را درون جار قرار دهید
5. با پیپت ۶ میلی لیتر آب در محل مشخص شده گازپک بریزید
6. فورا آن را بصورت عمودی در جار بگذارید
7. درب جار را بسته و از محکم بودن آن اطمینان حاصل کنید
8. جار را در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه نمایید و بعد از ۲ تا ۳ ساعت جار را چک کنید که معرف اکسیداسیون احیاء بی رنگ نشده باشد، اگر معرف بی رنگ بود گلوله های پالادیوم را جابه جا کنید و دوباره مراحل را اجرا کنید
9. لوله ها و پلیت ها را به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید

نکات مهم در حین انجام آزمایش

1. محیط تیوگلیکولات حاوی معرف های اکسیداسیون احیاء می باشد که در حضور اکسیژن به رنگ قرمز یا آبی کم رنگ تغییر رنگ می دهد، در صورتیکه عمقی بیشتر از ۱.۵ سانتیمتر از بالای لوله تغییر رنگ داده باشد، برای کشت دادن بی هوازی مناسب نیست و باید مجددا در بن ماری حرارت ببینند تا اکسیژن محلول در محیط کشت خارج گردد.
2. در زمان انکوباسیون لوله های کشت بی هوازی، از محکم بودن درب لوله اطمینان حاصل کنید تا از نفوذ اکسیژن به داخل محیط جلوگیری شود.
3. زمانی که از جار بی هوازی برای انکوباسیون استفاده می شود، درب لوله ها را کمی شل ببندید تا اکسیژن موجود در لوله بوسیله هیدروژن آزاد شده از سیستم گازپک خنثی گردد.