✍ چرخه انجام واکنش و برنامه دمایی

 در زمان انجام واکنش در دستگاه  چه رخ می دهد!؟

همانند PCR کیفی در دستگاه RealTime PCR، به طور تقریبی همان مراحل واکنش انجام می گیرد، با این تفاوت که شما فعل و انفعالات صورت گرفته در مراحل دوم و سوم واکنش را می توانید مشاهده کنید.

۱ – یک سیکل اختیاری ۲ دقیقه ای در دمای ۵۰ درجه سانتیگراد

این سیکل زمانی استفاده می شود که آنزیم UNG (Uracil N-glycosylase) برای حذف آلودگی های قبلی استفاده شده و این زمان باعث غیر فعال کردن آنزیم UNG در واکنش جدید می شود.

۲- یک سیکل ۲ تا ۱۵ دقیقه ای در دمای ۹۰ درجه سانتیگراد:

این سیکل برای فعال کردن آنزیم پلی مراز و واسرشته کردن قطعه بر اساس استفاده از نوع آنزیم پلی مراز و اندازه ی قطعه ی مورد نظر متغیر است.

۳ – سیکل مرحله اصلی PCR (به صورت ۳۰ تا ۵۰ تکرار):

حالت PCR دو پله ای : ۱۵ ثانیه در ۹۵ درجه ، اتصال و طویل سازی ۶۰ ثانیه در ۵۰-۶۰ درجه یا ۵ تا ۸ درجه پایین تر از کمترین Tm پرایمر.

حالت PCR سه پله ای : ۱۵ ثانیه در ۹۵درجه، ۳۰ ثانیه در دمای اتصال، طویل سازی ۲۰ ثانیه در ۷۲ درجه.
برای محاسبه مدت زمان طویل سازی از نظر تئوری برای هر ۲۰ جفت باز با آنزیم Taq پلی مراز ۱ ثانیه زمان لازم است. مرحله طویل سازی حداقل ۱۰ ثانیه باید طول بکشد. برای محصول بالاتر از ۵۰۰ جفت باز حداقل ۳۰ ثانیه زمان لازم می باشد.

مراحل سه گانه

۱- مرحله اول واسرشته شدن الگوی اولیه و نیز در صورت استفاده فعال سازی آنزیم DNA پلی مراز Hot start holding stage .

۲- مرحله دوم که مرحله ی PCR نیز نامیده می شود، مراحل واسرشته کردن، اتصال پرایمر الگو به هدف و تکثیر انجام می شود ( می توان این دو مرحله را در ۲ پله انجام داد به این معنا که دمای اتصال و تکثیر را در یک بازه زمانی و یک مرحله انجام دهیم. توصیه می شود که اگر دمای اتصال پرایمر شما زیر ۶۰ درجه باشد، این کار را انجام دهید).

مزیت PCR دو پله ای نسبت به سه پله ای، زمانی است که قطعه محصول کوتاه با دمای اتصال پائینی دارید یا دارای پرایمر چند حالته هستید. برای افزایش بازده، سرعت رمپ ( سرعت کاهش یا افزایش دما در واحد زمان ) را می توان افزایش داد ( برای زودتر رسیدن به مرحله ی طویل سازی در دمای ۷۲ درجه )، اما افزایش سرعت رمپ دستگاه می تواند منجر به افزایش تولید محصولات غیر اختصاصی شود. برای کاهش این اثر، زمانی که دمای اتصال پایین تر از ۶۰ درجه باشد می توان با حذف پله سوم و استفاده از توانایی عملکرد DNA پلی مراز در دمای ۵۵ تا ۷۵ درجه سانتیگراد مرحله اتصال و طویل سازی را در یک پله انجام دهید. دلیل انجام PCR سه پله ای در دمای اتصال بالای ۶۰ درجه هم به علت این که با توجه به بهترین عملکرد آنزیم DNA پلی مراز در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد است اگر دارای پرایمری با دمای اتصال ۶۲ درجه باشید به علت فاصله دمایی کم تا ۷۲ درجه نیاز به افزایش سرعت رمپ نیست و می توان از بهترین عملکرد آنزیم پلی مراز در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد استفاده کرد .

یک مرحله اختیاری: زمانی که تکثیر دایمر پرایمر نیز دارید و می خواهید داده های آن را در محاسبه نیاورید می توانید در PCR سه مرحله ای یک مرحله جمع آوری اطلاعات ۱۵ ثانیه ای بعداز مرحله طویل سازی در دمایی که بالاتر از Tm دایمر پرایمر باشد و ۳ درجه پایین تر از Tm محصول اصلی PCR است اضافه کنید. این روش باعث افزایش دامنه و اطمینان بیشتر به داده هایی که حاوی دایمر پرایمر در تکثیر بوده اند می شود. در واقع در دمای بین Tm دایمر پرایمر و Tm محصرل اصلي قطعات دايمر به صورت تک رشته ای در آمده فلورسنس آزاد نمی شود و دیگر میزان آن ها جزو داده های اصلی محاسبه نمی شود .

۳- مرحله ی سوم، منحنی آنالیز ذوب که در مورد رنگ های آزاد انجام می گیرد و این مرحله جزو قابلیت های دستگاه RealTime PCR نسبت به دستگاه ترموسایکلر PCR معمولی است.
این پروسه شامل یک مرحله دناتوراسیون ۹۵ درجه به مدت ۱۵ ثانیه که دلیل انجام این کار اطمینان از انجام پروسه بر روی قطعه های اختصاصی مورد نظر است سپس گرما دهی دقیق به قطعه ی DNA تکثیر یافته از دمای ۹۵ درجه به ۶۰ درجه انجام می شود همان طور که گفته شد رنگ های آزاد مثل سایبرگرین که رنگ های درج شونده (Intercalating ) گفته می شوند زمانی که بین دو رشته DNA قرار می گیرند و بر اثر دما دو رشته ی DNA از هم باز می شوند. رنگ های بین رشته ای آزاد می شود که همین باعث کاهش شدت فلورسانس آن ها می شود که به صورت پیک فلورسانس بر روی نمودار آنالیز ذوب مشاهده می شوند .در آغاز آنالیز افزایش سطح فلورسانس در نمونه به علت وجود میلیون ها کپی از قطعه های تولیدی می باشد، اما هر چه نمونه گرم تر می شود و دو رشته از هم باز می شود، میزان دو رشته ای DNA کاهش یافته و در نتیجه میزان فلورسانس کاهش پیدا می کند. دستگاه دارای یک دوربین است که اسن پروسه را به وسیله ی اندازه گیری فلورسانس تماشا می کند، دستگاه سپس به سادگی اطلاعات رت به صورت گراف به عنوان منحنی ذوب ( Melting curve ) میزان فلورسانس در مقابل درجه حرارت را نشان می دهد. دمای ذوب دو رشته DNA در حال باز شدن از هم کاملا قابل پیش بینی است که بستگی به توالی بازهای DNA (طول و میزان GC ) دارد.

بعد از اتمام واکنش PCR دستگاه RealTime به شما یک منحنی تکثیر می دهد که در بیشتر دستگاه ها به طور پیش فرض منحنی تکثیر به صورت محورهای سیکل بر فلورسانس Rn یا ΔRn نمایش داده می شود ،Rn فلورسانس خام ناشی از گزارشگر تقسیم بر فلورسانس رنگ مرجع می باشد که سیگنال گزارشگر نرمال شده Rn (Normalized Reporter signal) نامیده می شود و اگر Rn  را از فلورسانس پس زمینه کم کنید، ΔRn حاصل می شود.

 تکنیک/روش RealTime PCR – بخش اول (انواع روشهای آزمایش)

تکنیک Real-Time PCR – بخش دوم (منحنی تکثیر محصولات)

تکنیک RealTime PCR – بخش سوم(مراحل انجام واکنش)

تکنیک Real time PCR – بخش چهارم(چرخه انجام واکنش)

تکینک RealTime PCR – بخش پنجم(اشکالات منحنی تکثیر -۱)

تکینک RealTime PCR -بخش ششم(اشکالات منحنی تکثیر-۲)